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甘蓝型油菜是一种重要的油料作物,常遭受病原物侵害,因此,利用分子技术筛选抗病基因对于抗病育种尤为重要。NBS-LRR抗病基因家族作为最大的一类抗病基因,在植物抗病防卫中起着重要的作用。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对NBS-LRR类抗病基因BnTNLR1进行突变,并分析了BnTNLR1基因在参与油菜抗菌核病的功能。研究过程及结果如下:1.通过对BnTNLR1基因进行核盘菌诱导表达实验,发现油菜在接种核盘菌后,基因表达明显上调,呈先升后降的趋势,侵染3h后,BnTNLR1基因表达量明显上调,达到未侵染时的7倍,处理12h时达到最高值,约为未侵染的15倍。利用花粉介导转化法将CRISPR/Cas9基因编辑载体pRGEB31-Cas9-BnTNLR1转到5147B品系甘蓝型油菜中,获得了19株转基因油菜,经测序发现共得到7株突变体,突变类型均为杂合单碱基替换突变,qRT-PCR分析发现,突变体植株的BnTNLR1基因表达水平有不同程度下降,下降程度由5%-80%不等。2.在野生型和突变体油菜叶片上接种核盘菌菌丝块,在接种48h,72h后观察病斑大小,发现,接菌48h、72h后,突变体植株的病斑面积均显著大于野生型,表明,BnTNLR1基因被突变之后,降低了油菜对菌核病的抗性。测定核盘菌侵染油菜48小时后病斑周围叶片SOD、CAT酶活,结果显示,突变体植株SOD、CAT酶活均显著低于野生型,其中SOD酶活下降为野生型的30.3%-90.9%,CAT酶活下降为野生型的47.8%-91.3%,表明BnTNLR1基因的敲除,使SOD、CAT酶活降低。测定油菜SA合成基因ICS1、SA通路标志基因PR1、JA合成基因AOS、JA/ET通路共同标志基因PDF1.2以及PGIP2基因表达量,测定结果表明,突变体植株抗病相关基因表达量与野生型相比显著下调,PDF1.2基因下降程度最大,下降范围在79%-91%之间,AOS基因下降了56%-89%,ICS1基因下降了40%-88%,PR1基因下降程度在28%-79%之间。利用qRT-PCR技术分析BnTNLR1基因在油菜不同组织的表达特性,结果显示,BnTNLR1基因在油菜叶片中表达量最高、其次是根,在花中的表达量最低,BnTNLR1基因在油菜茎生叶叶片中的表达量是根中的2倍。3.对BnTNLR1基因和30个与BnTNLR1基因高度相似的NBS-LRR蛋白做发育进化分析,结果显示BnTNLR1与已知抗青枯病功能的拟南芥RRS1-R基因聚类在一起,通过Blast序列比对发现,与拟南芥RRS1-R基因序列相似度为52.39%。蛋白保守基序分析结果表明,BnTNLR1具有与TIR-NBS-LRR类抗病蛋白相同的保守基序,染色体定位分析发现,BnTNLR1基因位于A1染色体上。上述研究结果初步表明,BnTNLR1参与了甘蓝型油菜对菌核病的抗性防卫反应,BnTNLR1基因的表达可以增强甘蓝型油菜对菌核病的抗性。