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背景和目的
据报道，2019年美国前列腺癌(prostate cancer, PCa)预计新发病例为174,650人，而由于肿瘤死亡的病例预计高达31,620人。在美国男性中，PCa发病率在所有新发肿瘤中最高(约20%)，死亡率则位居所有恶性肿瘤中的第二位。而在我国，PCa的发病率较欧美国家低(＜10%)，然而死亡率/发病率比却显著高于欧美国家，达到了50%。原发性PCa发生转移是晚期PCa高病死率的主要原因，最常见的转移部位为中轴骨，而内脏转移(如肺脏、肝脏等)相对少见。据报道，我国有超过50%的PCa患者在初诊时已经发生骨和内脏等远处转移。目前针对晚期转移性PCa缺乏有效的治疗办法，预后很差。因此，阐明PCa远处转移发生过程中的作用机制对于探讨转移性PCa的防治策略以及改善疾病预后生存期具有重要的临床意义。
外泌体(exosome)是能被大多数细胞分泌的微小囊泡(直径：50-150nm)，内含多种蛋白质、脂质和微小RNA(如microRNA,miRNA)，是可以促进供体细胞和靶细胞间信号通讯的“生物活性囊泡”家族，参与到多种疾病的生理病理过程中。目前研究发现，exosome与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞可释放大量的exosome，通过作用并调节受体细胞的免疫反应，构建转移前微环境从而促进肿瘤细胞归巢至目的转移器官，实现肿瘤的远处转移。而在这一过程中，exosome内含的特异性miRNA可能扮演着至关重要的角色。已有文献报道，前列腺癌细胞分泌的exosome可将miRNA递送至血管内皮细胞并调控其基因转录，进而促使肿瘤的血管生成及转移。因此，exosome内含的miRNA可能参与到PCa的发生发展机制当中，然而目前针对exosome来源miRNA在前列腺癌，特别是转移性前列腺癌的研究仍然较少。
本研究旨在筛选局限性PCa和骨转移性PCa患者血清exosome差异表达的miRNA，探索关键miRNA对PCa细胞生物学功能的影响及其在PCa中的临床应用价值，本研究进行了如下四部分实验：
第一部分：转移性PCa和局限性PCa患者血清exosome收集及差异表达miRNA筛选
目的：高通量测序筛选局限性PCa和骨转移性PCa外泌体中差异表达的miRNA，为探索外泌体miRNA在PCa发生发展中的生物学功能奠定基础。方法：收集局限性PCa和骨转移性PCa患者血清，提取并鉴定exosome。通过高通量测序技术筛选出差异表达的miRNAs并进一步与Taylor数据库(内含的miRNA表达谱芯片数据中包含了113个原发性PCa病例，并且记录了详细的临床随访资料)中非转移性PCa和转移性PCa患者前列腺癌组织中差异表达的miRNA做比对，筛选出表达趋势相同、有显著统计学意义的miRNA。并进一步通过qRT-PCR验证特定miRNA在正常前列腺上皮和前列腺癌细胞株的表达以及分析Taylor数据库中特定miRNA的临床意义。结果：透射电镜、纳米示踪分析和exosome特异性表面标志物蛋白表达的检测结果表明我们成功提取了exosome。经高通量测序分析发现，骨转移性PCaexosome中miRNA较局限性PCa表达显著下调(P＜0.05)的miRNA有160种，而上调有统计学意义的miRNA共102种。在Taylor数据库中，与非转移性PCa组相比，转移性PCa患者前列腺癌组织中下调有统计学意义的miRNA共111种，而上调有意义的miRNA共41种。经比对后发现，得到了5种共同下调的miRNA(hsa-miR-361-5p ， hsa-miR-324-5p，hsa-miR-139-5p，hsa-miR-199b-5p，hsa-miR-199a-3p)以及一种共同上调的miRNA(hsa-miR-632)。qRT-PCR结果表明，miR-199b-5p的表达在激素敏感、表达雄激素受体、淋巴转移性、恶性程度较低的LNCaP细胞中表达相对较高。而在激素非依赖、骨转移性、恶性程度较高的PC-3和V-CaP细胞中表达显著下调(P均＜0.001)，与我们的预期结果相符，并且差异较其他miRNA最为显著，因此我们将miR-199b-5p作为最终后续研究的miRNA。Taylor数据库结果表明，低表达水平的miR-199b-5p与PCa预后差有关，miR-199b-5p可以作为PCa生化复发的预测因子。结论：exosome来源miR-199b-5p可能在PCa远处转移过程中发挥重要作用。
第二部分：ExosomalmiR-199b-5p对前列腺癌细胞增殖、迁移及远处转移的影响
目的：探讨miR-199b-5p在高表达和抑制其生物学功能的条件下对PCa细胞增殖、迁移和远处转移的影响。方法：阴性对照(正常对照)、调高miR-199b-5p表达和抑制miR-199b-5p生物学功能的慢病毒载体分别感染LNCaP、C4-2和PC-3细胞分别建立NC组、稳定过表达miR-199b-5p(miR-199b-5p组)和抑制miR-199b-5p功能(anti-miR-199b-5p组)的细胞株。通过MTS实验和平板克隆形成实验验证不同组别细胞的增殖能力，并通过划痕实验和transwell实验检测各组细胞的迁移能力。小鼠皮下成瘤实验和活体成像实验分别探讨miR-199b-5p对PCa细胞生长和远处转移的影响。结果：qRT-PCR结果表明，经过表达miR-199b-5p的慢病毒液感染细胞后，其miR-199b-5p的表达显著提高(LNCaP、C4-2和PC-3细胞分别较NC组升高了101倍、63倍和199倍，P值分别为0.001，0.001和＜0.001)；而anti-miR-199b-5病毒液处理后，各细胞的miR-199b-5p的表达较NC组无明显变化(P均＞0.05)，但长时间嘌呤霉素筛选实验证明了经anti-miR-199b-5p病毒液感染后的细胞已带有嘌呤霉素抗性(表明已插入了正确的序列)，尽管qRT-PCR检测无显著变化，但细胞内的miR-199b-5p已被封闭并且没法发挥生物学作用(loss-of-function)。在成功构建了稳定细胞株后，我们通过MTS和平板克隆形成实验发现，在LNCaP、C4-2和PC-3细胞中稳定过表达miR-199b-5p后，其增殖能力均较相应的NC组下降；而经anti-miR-199b-5p处理，细胞的增殖能力显著升高。划痕实验和transwell实验结果表明，上调miR-199b-5p表达可显著抑制三种PCa细胞的迁移能力，而抑制miR-199b-5p功能后则使PCa细胞的迁移能力提高(P均＜0.05)。体内实验结果表明，上调miR-199b-5p表达可显著减缓LNCaP和PC-3细胞的移植瘤形成和抑制LNCaP和PC-3细胞的远处肺转移(P均＜0.05)，而抑制miR-199b-5p功能后则可促进LNCaP和PC-3细胞皮下移植瘤的生长和远处转移。而在C4-2细胞中，miR-199b-5p的表达改变不能主导肿瘤细胞的远处转移(P=0.765)。结论：体外和体内实验结果共同表明miR-199b-5p对PCa细胞的增殖、迁移和转移起着负性调控的作用。
第三部分：miR-199b-5p通过靶向调控DDR1的表达抑制前列腺癌细胞的远处转移
目的：预测并验证miR-199b-5p的靶基因，进一步观察改变靶基因表达后对PCa细胞的生物学行为变化以及可能作用的信号通路。方法：通过TargetScan、miRDB、miRWalk和miRTarBase生物信息学工具对miR-199b-5p可能结合的靶基因进行预测，并在细胞系中验证。通过双荧光素酶报告基因检测系统对靶基因进行验证。皮下移植瘤和肺转移瘤再次验证靶基因的表达水平。在建立稳定过表达和沉默靶基因的PCa稳定细胞株后，探讨其对细胞增殖和迁移能力的影响。“挽救实验”探讨DDR1能否扭转由于过表达miR-199b-5p所致的细胞增殖和迁移能力下降。检测MAPK/ERK(丝裂原活化蛋白激酶/胞外信号调控激酶)和EMT(上皮-间质转化)相关分子的表达，探讨其相关性。结果：四个生物信息学工具共同预测miR-199b-5p的下游靶基因可能是CCNL1(细胞周期素L1)和DDR1(盘状结构域受体1)。Westernblot结果表明，DDR1的蛋白表达在miR-199b-5p组中显著下调(P＜0.001)，而在anti-miR-199b-5p组中显著上调(P=0.001)，而CCNL1的蛋白表达与miR-199b-5p的表达无显著相关性(P＞0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-199b-5p显著降低了携带DDR1野生型3’UTR序列报告载体的活性(P＜0.001)，而对突变型3’UTR序列报告载体的活性没有明显影响，因此DDR1的检测位点就是miR-199b-5p的结合位点。过表达miR-199b-5p组小鼠皮下移植瘤和肺转移灶中的DDR1表达明显低于NC组小鼠，而anti-miR-199b-5p组的DDR1表达明显高于NC组小鼠(P均＜0.05)。稳定调高DDR1表达后可促进LNCaP细胞的增殖和迁移能力(P均＜0.05)，而敲低DDR1表达后则抑制PC-3细胞的增殖和迁移能力(P均＜0.05)。挽救实验结果表明，DDR1能够部分扭转由于miR-199b-5p所致的细胞增殖和迁移能力下降。Westernblot结果提示DDR1可以作用于MAPK/ERK信号通路，并且与EMT相关(结合形态学变化)。结论：miR-199b-5p通过靶向调控DDR1的表达抑制PCa细胞的增殖、迁移和远处转移，其作用机制可能与作用于MAPK/ERK信号通路有关。
第四部分：miR-199b-5p及其靶基因DDR1的临床意义探索
目的：进一步探索miR-199b-5p及其靶基因DDR1在PCa中的临床意义。方法：收集局限性、盆腔淋巴结转移性、骨转移性PCa患者血清exosome，提取相应RNA以qRT-PCR检测miR-199b-5p的表达。在人前列腺癌组织标本中验证DDR1的表达。Cox风险模型评估影响生化复发或总体生存的因素。应用Kaplan-Meier生存曲线对DDR1高/低表达的PCa患者进行生存分析。通过生物信息学网站TCGA和NCBIGEO数据库验证DDR1对PCa患者预后的影响。结果：以局限性PCa患者血清exosomemiR-199b-5p表达作为对照时，有70%淋巴结转移PCa患者和80%骨转移性PCa患者表现出miR-199b-5p的表达下调。组织标本验证结果表明，DDR1阳性表达与PCa的生化复发显著相关(P=0.003)；DDR1阳性可作为预测生化复发的独立危险因素(HR=4.93，95%CI：1.5-16.22)；DDR1高表达组患者降低了患者术后的总体无生化复发生存率(P=0.028)。TCGA数据库和NCBIGEO数据库共同表明，高表达水平的DDR1与PCa的不良预后有关(P均＜0.05)。结论：miR-199b-5p在盆腔淋巴结转移和骨转移性PCa患者血清exosome中低表达；miR-199b-5p的靶基因DDR1与PCa的不良结局成正相关关系。
全文总结：
1.血清外泌体来源的miR-199b-5p能有效抑制前列腺癌细胞的体外增殖和迁移能力，同时可以有效抑制小鼠皮下移植瘤的生长和减少PCa细胞的远处转移。miR-199b-5p的低表达水平可降低接受前列腺癌根治术后的无生化复发生存率。
2.DDR1是miR-199b-5p互补的下游靶基因，参与miR-199b-5p调控PCa细胞的增殖、迁移和远处转移的机制当中。DDR1的高表达水平与PCa的不良预后有关。
3.ExosomalmiR-199b-5p-DDR1信号轴揭示了PCa细胞发生远处转移的分子机制，有望成为治疗PCa的新靶标。
据报道，2019年美国前列腺癌(prostate cancer, PCa)预计新发病例为174,650人，而由于肿瘤死亡的病例预计高达31,620人。在美国男性中，PCa发病率在所有新发肿瘤中最高(约20%)，死亡率则位居所有恶性肿瘤中的第二位。而在我国，PCa的发病率较欧美国家低(＜10%)，然而死亡率/发病率比却显著高于欧美国家，达到了50%。原发性PCa发生转移是晚期PCa高病死率的主要原因，最常见的转移部位为中轴骨，而内脏转移(如肺脏、肝脏等)相对少见。据报道，我国有超过50%的PCa患者在初诊时已经发生骨和内脏等远处转移。目前针对晚期转移性PCa缺乏有效的治疗办法，预后很差。因此，阐明PCa远处转移发生过程中的作用机制对于探讨转移性PCa的防治策略以及改善疾病预后生存期具有重要的临床意义。
外泌体(exosome)是能被大多数细胞分泌的微小囊泡(直径：50-150nm)，内含多种蛋白质、脂质和微小RNA(如microRNA,miRNA)，是可以促进供体细胞和靶细胞间信号通讯的“生物活性囊泡”家族，参与到多种疾病的生理病理过程中。目前研究发现，exosome与肿瘤的发生发展密切相关。肿瘤细胞可释放大量的exosome，通过作用并调节受体细胞的免疫反应，构建转移前微环境从而促进肿瘤细胞归巢至目的转移器官，实现肿瘤的远处转移。而在这一过程中，exosome内含的特异性miRNA可能扮演着至关重要的角色。已有文献报道，前列腺癌细胞分泌的exosome可将miRNA递送至血管内皮细胞并调控其基因转录，进而促使肿瘤的血管生成及转移。因此，exosome内含的miRNA可能参与到PCa的发生发展机制当中，然而目前针对exosome来源miRNA在前列腺癌，特别是转移性前列腺癌的研究仍然较少。
本研究旨在筛选局限性PCa和骨转移性PCa患者血清exosome差异表达的miRNA，探索关键miRNA对PCa细胞生物学功能的影响及其在PCa中的临床应用价值，本研究进行了如下四部分实验：
第一部分：转移性PCa和局限性PCa患者血清exosome收集及差异表达miRNA筛选
目的：高通量测序筛选局限性PCa和骨转移性PCa外泌体中差异表达的miRNA，为探索外泌体miRNA在PCa发生发展中的生物学功能奠定基础。方法：收集局限性PCa和骨转移性PCa患者血清，提取并鉴定exosome。通过高通量测序技术筛选出差异表达的miRNAs并进一步与Taylor数据库(内含的miRNA表达谱芯片数据中包含了113个原发性PCa病例，并且记录了详细的临床随访资料)中非转移性PCa和转移性PCa患者前列腺癌组织中差异表达的miRNA做比对，筛选出表达趋势相同、有显著统计学意义的miRNA。并进一步通过qRT-PCR验证特定miRNA在正常前列腺上皮和前列腺癌细胞株的表达以及分析Taylor数据库中特定miRNA的临床意义。结果：透射电镜、纳米示踪分析和exosome特异性表面标志物蛋白表达的检测结果表明我们成功提取了exosome。经高通量测序分析发现，骨转移性PCaexosome中miRNA较局限性PCa表达显著下调(P＜0.05)的miRNA有160种，而上调有统计学意义的miRNA共102种。在Taylor数据库中，与非转移性PCa组相比，转移性PCa患者前列腺癌组织中下调有统计学意义的miRNA共111种，而上调有意义的miRNA共41种。经比对后发现，得到了5种共同下调的miRNA(hsa-miR-361-5p ， hsa-miR-324-5p，hsa-miR-139-5p，hsa-miR-199b-5p，hsa-miR-199a-3p)以及一种共同上调的miRNA(hsa-miR-632)。qRT-PCR结果表明，miR-199b-5p的表达在激素敏感、表达雄激素受体、淋巴转移性、恶性程度较低的LNCaP细胞中表达相对较高。而在激素非依赖、骨转移性、恶性程度较高的PC-3和V-CaP细胞中表达显著下调(P均＜0.001)，与我们的预期结果相符，并且差异较其他miRNA最为显著，因此我们将miR-199b-5p作为最终后续研究的miRNA。Taylor数据库结果表明，低表达水平的miR-199b-5p与PCa预后差有关，miR-199b-5p可以作为PCa生化复发的预测因子。结论：exosome来源miR-199b-5p可能在PCa远处转移过程中发挥重要作用。
第二部分：ExosomalmiR-199b-5p对前列腺癌细胞增殖、迁移及远处转移的影响
目的：探讨miR-199b-5p在高表达和抑制其生物学功能的条件下对PCa细胞增殖、迁移和远处转移的影响。方法：阴性对照(正常对照)、调高miR-199b-5p表达和抑制miR-199b-5p生物学功能的慢病毒载体分别感染LNCaP、C4-2和PC-3细胞分别建立NC组、稳定过表达miR-199b-5p(miR-199b-5p组)和抑制miR-199b-5p功能(anti-miR-199b-5p组)的细胞株。通过MTS实验和平板克隆形成实验验证不同组别细胞的增殖能力，并通过划痕实验和transwell实验检测各组细胞的迁移能力。小鼠皮下成瘤实验和活体成像实验分别探讨miR-199b-5p对PCa细胞生长和远处转移的影响。结果：qRT-PCR结果表明，经过表达miR-199b-5p的慢病毒液感染细胞后，其miR-199b-5p的表达显著提高(LNCaP、C4-2和PC-3细胞分别较NC组升高了101倍、63倍和199倍，P值分别为0.001，0.001和＜0.001)；而anti-miR-199b-5病毒液处理后，各细胞的miR-199b-5p的表达较NC组无明显变化(P均＞0.05)，但长时间嘌呤霉素筛选实验证明了经anti-miR-199b-5p病毒液感染后的细胞已带有嘌呤霉素抗性(表明已插入了正确的序列)，尽管qRT-PCR检测无显著变化，但细胞内的miR-199b-5p已被封闭并且没法发挥生物学作用(loss-of-function)。在成功构建了稳定细胞株后，我们通过MTS和平板克隆形成实验发现，在LNCaP、C4-2和PC-3细胞中稳定过表达miR-199b-5p后，其增殖能力均较相应的NC组下降；而经anti-miR-199b-5p处理，细胞的增殖能力显著升高。划痕实验和transwell实验结果表明，上调miR-199b-5p表达可显著抑制三种PCa细胞的迁移能力，而抑制miR-199b-5p功能后则使PCa细胞的迁移能力提高(P均＜0.05)。体内实验结果表明，上调miR-199b-5p表达可显著减缓LNCaP和PC-3细胞的移植瘤形成和抑制LNCaP和PC-3细胞的远处肺转移(P均＜0.05)，而抑制miR-199b-5p功能后则可促进LNCaP和PC-3细胞皮下移植瘤的生长和远处转移。而在C4-2细胞中，miR-199b-5p的表达改变不能主导肿瘤细胞的远处转移(P=0.765)。结论：体外和体内实验结果共同表明miR-199b-5p对PCa细胞的增殖、迁移和转移起着负性调控的作用。
第三部分：miR-199b-5p通过靶向调控DDR1的表达抑制前列腺癌细胞的远处转移
目的：预测并验证miR-199b-5p的靶基因，进一步观察改变靶基因表达后对PCa细胞的生物学行为变化以及可能作用的信号通路。方法：通过TargetScan、miRDB、miRWalk和miRTarBase生物信息学工具对miR-199b-5p可能结合的靶基因进行预测，并在细胞系中验证。通过双荧光素酶报告基因检测系统对靶基因进行验证。皮下移植瘤和肺转移瘤再次验证靶基因的表达水平。在建立稳定过表达和沉默靶基因的PCa稳定细胞株后，探讨其对细胞增殖和迁移能力的影响。“挽救实验”探讨DDR1能否扭转由于过表达miR-199b-5p所致的细胞增殖和迁移能力下降。检测MAPK/ERK(丝裂原活化蛋白激酶/胞外信号调控激酶)和EMT(上皮-间质转化)相关分子的表达，探讨其相关性。结果：四个生物信息学工具共同预测miR-199b-5p的下游靶基因可能是CCNL1(细胞周期素L1)和DDR1(盘状结构域受体1)。Westernblot结果表明，DDR1的蛋白表达在miR-199b-5p组中显著下调(P＜0.001)，而在anti-miR-199b-5p组中显著上调(P=0.001)，而CCNL1的蛋白表达与miR-199b-5p的表达无显著相关性(P＞0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果表明miR-199b-5p显著降低了携带DDR1野生型3’UTR序列报告载体的活性(P＜0.001)，而对突变型3’UTR序列报告载体的活性没有明显影响，因此DDR1的检测位点就是miR-199b-5p的结合位点。过表达miR-199b-5p组小鼠皮下移植瘤和肺转移灶中的DDR1表达明显低于NC组小鼠，而anti-miR-199b-5p组的DDR1表达明显高于NC组小鼠(P均＜0.05)。稳定调高DDR1表达后可促进LNCaP细胞的增殖和迁移能力(P均＜0.05)，而敲低DDR1表达后则抑制PC-3细胞的增殖和迁移能力(P均＜0.05)。挽救实验结果表明，DDR1能够部分扭转由于miR-199b-5p所致的细胞增殖和迁移能力下降。Westernblot结果提示DDR1可以作用于MAPK/ERK信号通路，并且与EMT相关(结合形态学变化)。结论：miR-199b-5p通过靶向调控DDR1的表达抑制PCa细胞的增殖、迁移和远处转移，其作用机制可能与作用于MAPK/ERK信号通路有关。
第四部分：miR-199b-5p及其靶基因DDR1的临床意义探索
目的：进一步探索miR-199b-5p及其靶基因DDR1在PCa中的临床意义。方法：收集局限性、盆腔淋巴结转移性、骨转移性PCa患者血清exosome，提取相应RNA以qRT-PCR检测miR-199b-5p的表达。在人前列腺癌组织标本中验证DDR1的表达。Cox风险模型评估影响生化复发或总体生存的因素。应用Kaplan-Meier生存曲线对DDR1高/低表达的PCa患者进行生存分析。通过生物信息学网站TCGA和NCBIGEO数据库验证DDR1对PCa患者预后的影响。结果：以局限性PCa患者血清exosomemiR-199b-5p表达作为对照时，有70%淋巴结转移PCa患者和80%骨转移性PCa患者表现出miR-199b-5p的表达下调。组织标本验证结果表明，DDR1阳性表达与PCa的生化复发显著相关(P=0.003)；DDR1阳性可作为预测生化复发的独立危险因素(HR=4.93，95%CI：1.5-16.22)；DDR1高表达组患者降低了患者术后的总体无生化复发生存率(P=0.028)。TCGA数据库和NCBIGEO数据库共同表明，高表达水平的DDR1与PCa的不良预后有关(P均＜0.05)。结论：miR-199b-5p在盆腔淋巴结转移和骨转移性PCa患者血清exosome中低表达；miR-199b-5p的靶基因DDR1与PCa的不良结局成正相关关系。
全文总结：
1.血清外泌体来源的miR-199b-5p能有效抑制前列腺癌细胞的体外增殖和迁移能力，同时可以有效抑制小鼠皮下移植瘤的生长和减少PCa细胞的远处转移。miR-199b-5p的低表达水平可降低接受前列腺癌根治术后的无生化复发生存率。
2.DDR1是miR-199b-5p互补的下游靶基因，参与miR-199b-5p调控PCa细胞的增殖、迁移和远处转移的机制当中。DDR1的高表达水平与PCa的不良预后有关。
3.ExosomalmiR-199b-5p-DDR1信号轴揭示了PCa细胞发生远处转移的分子机制，有望成为治疗PCa的新靶标。