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心血管疾病严重危害着人类的健康,而其中血管内膜的损伤是多种心血管疾病的早期阶段和起因。内膜损伤后,血管内皮层功能紊乱并脱落,暴露出下层胶原纤维,并在后期形成新生内膜,造成血管重建。因此,加速损伤处的再内皮化修复,对于维持血管稳态以及预防血管疾病的产生和发展有着重要意义。已有研究表明,内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells,EPCs)在血管内膜损伤修复中发挥主要作用。内膜损伤发生后,EPCs自骨髓被动员释放到外周血,并归巢粘附至血管损伤部位,增殖、分化为内皮细胞(Endothelialcells,ECs)从而参与内膜修复。同时,损伤后大量血小板被富集粘附至胶原纤维层,胶原刺激产生大量的血小板源性微囊(platelet-derivedmicrovesicles,PMVs),形成局部富集的微环境。PMVs含有大量的蛋白和遗传物质,可参与调控细胞的信号传递和功能;然而在损伤修复的过程中,PMVs对EPCs中信号通路的调节及功能的调控作用仍然未知。本研究主要关注内膜损伤过程中,受到胶原激活后血小板释放的活化PMVs(ac.PMVs),通过传递携带的信号分子调控EPCs增殖和分化中的作用和可能的机制。本文首先通过构建大鼠颈动脉内膜损伤模型,以对侧未损伤血管为对照,使用HE染色及免疫荧光染色,检测损伤血管部位的变化;通过检测内皮相标志物血管性血友病因子(vonWillebrandFactor,vWF)、造血干细胞标志物CD34以及血小板标志物CD41的表达情况,证实血管内膜损伤后PMVs和EPCs在损伤部位粘附和共定位。其次,体外实验中我们使用密度梯度离心法,从大鼠骨髓获得EPCs后进行体外培养;使用差速离心法,从大鼠腹主动脉取血,并使用胶原刺激血小板获得ac.PMVs。使用ac.PMVs刺激EPCs1h或者24h后,结果显示EPCs增殖能力显著增强,并向内皮相分化。生物信息学分析表明,与EPCs增殖和分化能力相关的蛋白中,Smad家族的分子在信号通路调控中起到重要作用。通过蛋白免疫印迹法检测,ac.PMVs刺激1h后EPCs中与增殖相关的p-Smad3表达水平显著增加,与分化相关的p-Smad1/5表达水平显著降低。同时,刺激24h后Smad3分子发生核质转位,蛋白由细胞质进入、聚集到细胞核中,并调节下游和增殖相关的靶基因TNC,CDKN1A和CDKN2A的表达。转化生长因子β1(TransformingGrowthFactor-β1,TGF-β1)是Smad3的上游分子,并且在干细胞生长、增殖中起到关键作用。我们发现相比于未用胶原激活的微囊,在ac.PMVs中TGF-β1的含量显著增加。使用外源重组蛋白TGF-β1对细胞的刺激结果显示,EPCs中Smad3磷酸化增加,24h后细胞核内Smad3聚集,EPCs增殖能力增强,与前期ac.PMVs刺激结果一致。此外,使用TGF-β1通路特异性抑制剂SB431542,以及Smad3磷酸化的抑制剂SIS3,验证了ac.PMVs传递TGF-β1对信号传递和EPCs增殖的调控作用。为了从分子水平进一步证明TGF-β1在此过程中的重要作用,实验引入了人成巨核细胞白血病细胞株MEG-01,应用RNA干扰获得MEG-01来源的TGF-β1低表达血小板微囊,验证了血小板微囊传递的TGF-β1在EPCs增殖中的重要作用。体内实验中,在大鼠颈动脉内膜损伤后局部孵育EPCs,尾静脉注射TGF-β1重组蛋白4天。与对照组相比,r-TGF-β1显著促进EPCs的原位增殖,并促进血管再内皮化修复;而TGF-β1特异性抑制剂SB431542预处理后逆转了这一现象,提示TGF-β1在血管损伤部位提高了EPCs的增殖能力,促进了内膜损伤修复。综上,我们的结果表明,内膜损伤后暴露的胶原物质刺激局部富集的血小板产生大量的PMVs,PMVs将其中富含的TGF-β1传递至EPCs,从而激活细胞内Smad3磷酸化,进入细胞核后调节下游基因TNC,CDKN1A和CDKN2A的表达,并促进EPCs增殖;同时,ac.PMVs的刺激通过抑制p-Smad1/5的表达水平,促进了EPCs向内皮相的分化作用。本研究提示ac.PMVs传递的TGF-β1以及Smad家族分子,在调控EPCs参与内膜损伤修复中起到重要作用,为疾病中内膜损伤的修复提供了潜在的治疗靶点。