随着基因组医学的迅猛发展和进步,人们对耳聋的认识有了极大的提高。众多遗传性耳聋相关基因的发现以及由此而发展的耳聋基因诊断技术使得越来越多的神经性耳聋患者从中获益。耳聋的诊断、预防和干预与国民经济的发展和人口素质的提高关系非常密切。本研究利用题组前期研究发现的中国人群常见热点突变,使用用解放军总医院聋病分子诊断中心的现有仪器设备,发展了系列具有自主知识产权的聋病分子诊断技术,并且展示了良好的应用前景;同时,对于耳聋基因突变的分子流行病学研究以及听力表型的相关性分析上也取得了具有创新意义的成果。本研究包括以下五个部分。第一部分聋病基因系列诊断技术的研究和应用掌握多种基因诊断方法可以根据不同的样本量和特定病例选择相应的诊断策略,使诊断过程更加快速、便捷、准确,真正建立起个性化的聋病诊疗体系,更好地为患者服务。该部分主要内容为我们建立并完善的常见聋病基因突变新的诊断方法,分为三章:第一章详细介绍了使用PAGE银染法配合试剂盒检测IVS7-2 A＞G突变;第二章阐述了应用试剂盒和PAGE银染法检测mt DNA A1555G突变,并和琼脂糖EB染色法做了比较;第三章描述了PCR-Genescan方法检测GJB2和线粒体突变的方法。这几种方法既可检测单个碱基突变或者同时检测多个突变,有操作简单、快速、经济,高效的特点。不同方法可以同时使用,使耳聋基因诊断的敏感性和特异性大大提高。第二部分中国新疆主要民族聋病基因突变的分子流行病学研究新疆的地理位置和民族特点是研究不同民族间分子流行病学的良好范例,我们在新疆地区的分子流行病学调查包括中国耳聋人群最常见的基因和突变GJB2、SLC26A4 IVS7-2A＞G以及mt DNAA1555G。新疆地区127例(汉族66,维族61)NSHL中,GJB2基因突变有较高的发生率,新疆维族的35delG携带率明显高于汉族,235delC在维族和汉族中均较为常见。GJB2 35delG突变在维族和汉族耳聋者的等位基因频率分别为7.4%(9/122)和0(0/128);而GJB2 235delC突变在维族和汉族耳聋者中分别为5.7%(7/122)和8.6%(/128)。新疆地区mtDNA A1555G汉族携带频率为10.24%(21/205),山东滨州的携带率6.67%(5/75),该突变在经济文化相对落后地区有相当高的阳性携带率。新疆地区汉族听力残疾人群IVS7-2 A＞G携带率12.2%(25/205),维族耳聋人群和对照组未发现IVS7-2 A＞G突变。在中国不同民族进行耳聋的流行病学调查由助于根据不同民族的突变位点制定相应的基因诊断策略,为耳聋的早期干预提供重要的预警手段。第三部分颞骨畸形和非综合征性耳聋相关基因SLC26A4IVS7-2A＞G突变的分子流行病学研究SLC26A4基因IVS7-2 A＞G是中国耳聋人群最热点的突变,我们使用自行研制的SLC26A4致病突变检测筛查试剂盒和直接测序法,对来自全国不同省市的散发NSHL患者进行SLC26A4 IVS7-2 A＞G突变的分子流行病学调查,为大前庭水管综合征的快速筛查和临床基因诊断提供证据。在中国大陆不同省市、地区,不同民族3271名耳聋患者中发现SLC26A4 IVS7-2A＞G纯合突变158例,杂合突变250例,总的携带率12.5%。不同地区、民族间的比较差别有统计学意义。SLC26A4基因的分子流行病学较GJB2更为复杂,同一地区不同国家间、同一国家不同民族间都存在明显的差异。我们对80例携带IVS7-2A＞G单杂合突变的病人进行了第二个突变的寻找,47例找到第二个突变,33例没有发现第二突变。IVS7-2A＞G单杂合突变找到另外一个突变的比例为58.8%(47/80)。共发现5种较为常见的突变(发现频率3次或者3次以上＞2.5%),最常见的是H723R,发生频率16%,占突变等位基因的比例34%,T410M、15+5G＞A和L676Q三种突变等位基因携带率为5%,N392Y等位基因携带率3.75%。外显子17的突变种类最多,共发现4种突变类型。因此对于SLC26A4单杂合突变,要积极寻找第二个突变,对于没有发现第二突变者,要考率突变可能在调控区或非编码区,还要考虑其他因素的影响。第四部分非综合征性耳聋mt DNA C1494T突变的分子流行病学研究MtDNA C1494T突变作为与药物性耳聋关系密切的突变,本研究应用FQ-PCR在全国范围内进行mtDNA C1494T的筛查,共完成检测样本3133例,发现C1494T突变14例,河南安阳4例、新疆地区2例、青海西宁1例、云南昆明2例、安徽阜阳2例、四川成都2例、福建福州1例,经测序验证全部为C1494T突变(图4.4),总的携带频率为0.45%(14/3133)。第五部分GJB2基因235delC单杂合突变携带者的听力表型分析GJB2基因型和表型的关系对于耳聋发病机理的理解有着重要影响,对于临床的基因诊断与咨询也有重要作用。该部分对235delC纯合突变携带者父母的听力表型特点进行了分析。结果表明GJB2致聋等位基因携带者表现为随年龄加重的高频听力下降,但是语频听力基本正常。父母单杂合突变携带者是听力早衰的危险因素,他们在中年时就可能出现听力下降的迹象。