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白细胞介素18(Interleukine-18, IL-18)是1995年由Okmura等从小鼠肝脏中克隆获得的一种细胞因子,主要由单核巨噬细胞系统的细胞分泌,具有强烈的IFN-γ诱生能力,对机体起着重要的免疫调节和保护作用,在抗微生物感染、抗肿瘤免疫中具有应用潜力。对人和哺乳动物IL-18的研究已有许多报道,而鸡IL-18(ChIL-18)基因发现得比较晚,由于它具有与人和哺乳动物相似的生物学功能,因此ChIL-18在比较免疫学研究和禽病治疗中具有重要意义。本实验室从2001年开始进行鸡白细胞介素18的研究,已经在原核系统中实现了鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)基因的高效表达,但由于该系统表达的蛋白存在非糖基化形式等缺陷,使得表达的蛋白分子常失去天然结构,因而对表达的重组蛋白的活性还存在争议。本试验利用昆虫/杆状病毒系统表达鸡白细胞介素18成熟蛋白,进而对该重组蛋白有效地进行了生物学活性检测。参考已发表的mChIL-18的cDNA基因序列,设计一对特异性引物,以pMD18-T-mChIL18质粒为模板,扩增出编码mChIL-18成熟蛋白基因的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBac TM HTb为载体,将mChIL-18基因插入到表达载体pFastBacTM HTb的多角体蛋白启动子PPH的下游,构建重组转移载体质粒pFastBacTM HTb-mChIL-18,然后将已构建好的重组转移载体质粒转座入大肠杆菌DH10BacTM感受态细胞中,经过三次蓝白斑筛选纯化后提取质粒,通过一对通用引物M13(Bacmid含有该引物Forward和Reverse两个引物位点,能够从两侧扩增LacZα互补区域内的mini-attTn7位点,有利于PCR分析)进行PCR扩增鉴定,得到重组Bacmid(Bacmid-mChIL18)。在转染试剂Cellfectin的作用下,通过脂质体介导法将纯化的Bacmid-mChIL-18转染至草地贪夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda 9,sf9)获得P1代重组杆状病毒,用P1代病毒反复感染sf9来扩增病毒滴度,将达到一定滴度(107~108pfu/mL)的重组杆状病毒再感染sf9,并在感染后不同时间段收获sf9细胞及培养上清,然后对细胞进行超声波破碎,离心后分别取裂解上清和沉淀,经SDS-PAGE电泳分析、Western blotting和间接免疫荧光(IFA)检测,结果表明,mChIL-18基因在昆虫细胞sf9中获得了表达,表达的目的条带分子量约为23KD。采用鸡脾淋巴细胞增殖试验(MTT法)、IFN-γ诱导实验和水疱性口炎病毒(VSV)抑制试验对表达的蛋白进行生物学活性测定。鸡脾淋巴细胞增殖试验表明,mChIL-18融合蛋白能够明显促进淋巴细胞的增殖,不同浓度的蛋白均可刺激淋巴细胞转化。当浓度为200ng/mL时,刺激转化效果最佳,但随着蛋白浓度的增大,淋巴细胞的增殖指数则会降低;VSV病毒活性抑制试验表明,当蛋白浓度大于100ng/mL时能刺激脾淋巴细胞产生IFN-γ,并且随着mChIL-18蛋白浓度的增加,诱导产生IFN-γ的量随之增加;将不同稀释度的IFN-γ分别作用于VSV,在IFN-γ≥1×102U/mL时,具有较强的抑制效果,当IFN-γ为10 U/mL时,只能达到50%的保护。该结果说明mChIL-18融合蛋白的抗病毒活性是通过IFN-γ实现的,且在一定浓度范围内具有抑制VSV病毒产生细胞病变的作用。