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原发性肝癌发生率高,手术切除是主要的治疗方法,但肝癌术后复发率高,术后复发已成为影响患者预后的主要问题。肝癌侵袭转移是主要的影响因素之一,深入研究肝癌侵袭转移机制对于改善肝癌患者的总体预后有重要作用。Rho家族属于Ras超家族,是重要的细胞内信号分子,在细胞的许多基础生命活动中起关键的作用。Rho蛋白和肿瘤发生有密切的关系,参与肿瘤的浸润和转移过程,目前研究证实,在结肠癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌、肝癌等有RhoA表达的异常增高。本研究利用RNA干扰技术干扰RhoA蛋白的表达,干扰信号转导途经,为进一步研究肿瘤细胞应力纤维变化,变形、移动、粘附和侵袭能力改变提供实验模型,最后了解RhoA和肝癌侵袭转移的关系。本研究丰要包括以下两个部分内容:第一部分:构建干扰RhoA的shRNA真核表达载体目的:利用pGenesil-1质粒构建针对RhoA的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体。方法:设计2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,胶回收酶切pGenesil-1大片段,T4 DNA Ligase连接酶切大片段和DNA序列,得到质粒pGenesil-1-siRhoA1和pGenesil-1-siRhoA2.转化感受态细胞DH5a,扩增,提取重组质粒进行酶切鉴定。结果:成功构建靶向RhoA的shRNA重组质粒载体.酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。结论:表达靶向RhoA的shRNA表达框成功构建在重组质粒载体上。第二部分:肝癌细胞中RhoA小干扰RNA载体的构建与鉴定目的:构建RhoA基因的RNA干扰(RNAi)载体。方法:根据人RhoA基因序列设计两条短双链,人工合成后,连接到人真核表达载体Pgenesil-1中,构成Pgenesil-1-siRhoA-1,Pgenesil-1-siRhoA-2两个重组质粒,转人人肝癌细胞(HEPG2)细胞中,Western blot方法检测RhoA-siRNA对RhoA表达的抑制效果,确定一个重组质粒进行下一步研究。结果:两质粒都有沉默RhoA基因的作用,Pgenesil-1-siRhoA-1重组质粒作用更强烈一些。结论:Pgenesil-1-siRhoA重组质粒的成功转染,为研究RhoA与肝细胞癌侵袭转移的关系提供实验模型.