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膀胱癌(bladder cancer)是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤,同时也是全身十大常见肿瘤之一,严重威胁着人类健康。手术是治疗膀胱癌的主要手段,同时并辅以放化疗以及生物治疗,但复发率高,总体生存率仍不理想。因而,在最新的分子生物学研究成果基础上,进一步研发有效的膀胱癌治疗方法,具有重大的理论和现实意义。当前,基因治疗仍旧占据着肿瘤研究的前沿阵地,其中自杀基因疗法是近年来肿瘤基因治疗研究的主力军,单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(herpes simplex virus thymidine kinase, HSV-TK)/丙氧鸟苷(ganciclovir, GCV)作为目前研究最早最彻底并且最有效的自杀基因系统之一,在肿瘤基因治疗中扮演着不可或缺的角色。就肿瘤基因治疗的载体系统而言,目前主要有病毒载体和非病毒载体(脂质体等),病毒载体本身有很多局限性,如病毒滴度低、宿主范围有限、插入宿主基因组可能引起突变及病毒本身缺乏安全性等缺点,脂质体等非病毒载体,普遍存在基因转染效率低、缺乏肿瘤特异靶向性等缺点,而双歧杆菌作为一种具有良好肿瘤靶向定植性的厌氧细菌很好的克服以往肿瘤基因治疗中缺乏肿瘤组织靶向性、安全性和转导效率低等“瓶颈”。前期实验中,我们采用双歧杆菌介导的HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠膀胱癌,发现膀胱肿瘤体积缩小、重量减轻,肿瘤细胞凋亡明显增加。本课题拟在前期研究基础上,对双歧杆菌介导的HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠膀胱癌组织进行比较蛋白质组学研究,寻求该治疗系统的作用靶标,并剖析靶标的功能,探索用双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠膀胱癌的分子机制。本论文分为二个部分。第一部分双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗荷瘤大鼠胱肿瘤的蛋白学研究研究目的：应用iTRAQ蛋白质组学技术研究双歧杆菌介导HSV-TK/GCV治疗大鼠膀胱癌的差异表达蛋白,从整体水平上揭示该治疗系统的作用机制,并筛选关键靶蛋白。研究方法：1.运用N一甲基亚硝基脲(MNU)膀胱灌注法建立大鼠膀胱肿瘤原位模型,诱导结束后经B超检查和病理切片判断是否建模成功。2.然后将建模成功的60只SD大鼠随机分为4组：双歧杆菌/PGEX-5X-1空质粒对照组(BI/PGEX-1)、双歧杆菌/PGEX-tk重组质粒实验组(BI-TK)、双歧杆菌对照组(BI)和生理盐水对照组(normal saline),每组15只,分别经大鼠尾静脉注射携带空质粒、重组质粒和未携带任何基因的双歧杆菌菌液lml(含婴儿双歧杆菌4.4×109个)以及生理盐水,每周给药1次,共4次。每只SD大鼠每天腹腔注射GCV(50mg/kg),共4周。3.分别取各组中部分大鼠膀胱癌组织包埋于石蜡中用于后续免疫组化检测,提取各组膀胱癌总蛋白,依照说明书分别标记肽段,114标记生理盐水对照组,115标记BI-TK组,116标记BI/PGEX-1组,117标记BI组。MALDI-TOF/TOF进行质谱分析。4.差异蛋白质分析：利用ProteinPilot软件分析质谱数据,用IPI rat protein database v3.49软件搜索与质谱匹配的蛋白。采用PANTHER classification system (http://www.pantherdb.org)对差异蛋白进行GO分析,运用IPA (http://www.ingenuity.com)对差异蛋白的信号通路进行分析。5.验证差异蛋白的表达：采用蛋白质免疫印迹方法(Western blot)和免疫组化技术检测各组膀胱癌组织中差异蛋白表达情况,从而验证蛋白组学研究的可靠性。研究结果：1.MNU膀胱灌注法建立膀胱癌模型过程中,有7只大鼠因麻醉过量死亡,有5只不明原因死亡,最后剩余63只。经B超检查均发现膀胱内新生物出现,随机抽取3只大鼠取膀胱内新生物病理检查证实为膀胱癌,余下60只大鼠随机分为4组。2.质谱分析结果：实验共鉴定出膀胱癌差异蛋白402个,其中经过治疗系统处理后有192个蛋白表达下调,210个蛋白表达下调。进一步通过生物信息学发现,Peroxiredoxki-Ⅰ (Prx-Ⅰ)与NF-κB信号通路联系紧密,并且经过上述治疗系统处理后Prx-Ⅰ表达明显下调,加之我们前期实验发现该治疗系统能使激活型的Caspase3表达增加,从而导致肿瘤细胞凋亡明显增加,因而Prx-Ⅰ可能参与到该治疗系统的机制当中。3.差异蛋白的功能分析：根据生物信息功能注释,差异蛋白主要参与代谢过程(26.9%)、细胞过程(13.6%)和细胞通讯过程(20.0%)3种生物过程。根据分子功能注释,差异蛋白主要执行催化功能(36.8%)、结合功能(28.4%)和结构性分子功能(15.1%)3种生物功能。根据蛋白种类注释,主要包含氧化还原酶(9.8%)、细胞骨架蛋白(8.9%)、转移酶(7.1%)、核酸结合蛋白(6.8%)及酶调节剂(6.2%)5部分。4. Western Blot检测Prx-Ⅰ的蛋白表达：与其他三组对比,BI-TK组中Prx-Ⅰ蛋白的表达量明显下调(P<0.001)。Westem-blot结果与iTRAQ研究结果一致。5.免疫组化检测Prx-Ⅰ在膀胱癌组织的表达情况。经过该治疗系统处理后的大鼠膀胱癌组织中,Prx-Ⅰ的表达明显降低,表达降低具有显著的统计学差异(P<0.001)。免疫组化结果与iTRAQ和Western Blot结果一致。结论：1.蛋白组学的新技术iTRAQ具有精确的定量效果,而且具有较好的重复性,能够更好地了解双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统的相关分子机制,并且寻找到该治疗过程中表达的关键蛋白及信号通路。2. iTRAQ分析并鉴定出治疗前后的大鼠膀胱癌组织中差异表达蛋白402个,其中有192个蛋白表达下调,210个蛋白表达下调。通过生物信息学分析,Prx-Ⅰ与NF-κB信号通路联系紧密,加之前期实验结果,我们推测双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统是通过下调Prx-Ⅰ表达然后作用于NF-κB信号通路增加膀胱癌的凋亡从而达到治疗效果。3. Western Blot和免疫组化实验结果与iTRAQ分析结果一致,均证实治疗后Prx-Ⅰ蛋白在大鼠膀胱癌组织中表达水平明显下调,这一方面验证了iTRAQ技术的可靠性,另一方面为进一步研究双歧杆菌介导HSV-TK/GCV自杀基因治疗系统的作用机制提供了关键的候选靶点。第二部分Prx-Ⅰ在膀胱癌细胞中的作用及机制研究研究目的：1.构建Prx-Ⅰ干扰质粒shRNA转染膀胱癌细胞株T24,观察对膀胱癌细胞生物学行为的影响。2.研究Prx-Ⅰ与NF-κB信号通路的关系。研究方法：1.构建3条针对Prx-Ⅰ的干扰shRNA序列以及无关序列作为阴性对照,通过实时定量PCR (qPCR)和Western Blot筛选最适干扰序列。2.CCK8检测沉默Prx-Ⅰ基因表达后膀胱癌细胞T24的细胞增值能力。3.流式细胞仪检测沉默Prx-Ⅰ基因表达后膀胱癌细胞T24的凋亡与细胞周期情况。4.利用Western Blot检测沉默Prx-Ⅰ基因表达后膀胱癌细胞T24细胞核内phospho-NF-KB p50和p65表达,以反映NF-κB信号通路的活化情况。研究结果：1.抑制膀胱癌细胞T24中Prx-Ⅰ表达能抑制其增值能力,与无关序列组(4.51±0.73%)和空白对照组(4.96±0.46%)凋亡率相比,干扰组(21.99±1.10%)凋亡率明显升高(P<0.001),并且G0/G1期所占比例,干扰组(61.13±.50%)远高于无关序列组(49.62±0.84%)和空白对照组(48.03±1.17%),故抑制膀胱癌细胞T24中Prx-Ⅰ表达能阻滞膀胱癌细胞周期于G0/G1期(P<0.05)。2.抑制Prx-Ⅰ表达后膀胱癌细胞T24胞核内phospho-NF-KB p50 and p65表达降低。结论：1.抑制Prx-Ⅰ基因表达后可见膀胱癌细胞T24增值能力下降,并且凋亡增加,细胞周期阻滞于G0/G1期。2.抑制Prx-Ⅰ基因表达能抑制膀胱癌细胞T24胞核内phospho-NF-κB p50和p65表达,抑制NF-κB通路活化,从而导致膀胱癌细胞凋亡。