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本研究应用细胞培养、质粒提取、脂质体转染、逆转录PCR、共聚焦显微定位、流式细胞仪分类、MTT、实时荧光定量PCR等技术,通过比较几种SS和MSTN基因质粒转染对宫颈癌Hela细胞生长和增殖的作用,旨在:(1)筛选促进Hela细胞凋亡效果最佳的质粒,为开发肿瘤基因治疗新技术奠定基础;(2)探讨SS和MSTN抗肿瘤的作用通路,为进一步提高肿瘤基因治疗效果奠定基础;(3)从转录和表达角度比较各种质粒在真核细胞中的表达量,为探讨SS基因疫苗作用机制,开发SS和MSTN基因疫苗奠定基础。主要研究内容和结果如下:
1.应用LipofectamineTM2000脂质体转染方法将SS基因质粒pEGS/2SS、pEGS2SS-V、pGS/2SS-M4GFP-asd、pGS/2SS-IL6-asd和MSTN基因质粒pEGMS及SS和MSTN混合基因质粒pEGS/2SS+pEGMS、pEGS2SS-V+pEGMS转染到Hela细胞中,转染后48h,提取总RNA,反转录后电泳检测到SS和MSTN,说明SS和MSTN基因质粒在Hela细胞中能够正常转录;
2.上述基因质粒转染Hela细胞后48h,用DAPI避光染色、应用共聚焦显微镜亚细胞定位,发现SS融合蛋白在细胞核中表达,MSTN融合蛋白则在细胞核和细胞质中都有表达;
3.上述基因质粒转染Hela细胞后24h、48h、72h和96h,用MTT法检测细胞增殖的情况,并与对照组比较,发现试验组明显抑制细胞生长(P＜0.05),尤其是用pEGMS质粒转染后72h的细胞生长抑制作用最明显。
4.应用Annexin V-APC/7-AAD双染色法检测SS和MSTN基因质粒转染Hela细胞后48h的凋亡情况,并与对照组比较,发现试验组的R5区细胞(即早期凋亡细胞)明显增加(P＜0.05),其中,pEGMS试验组的凋亡率(27.474±2.86％)最高,比对照组高8.15％。表明SS和MSTN基因质粒可促进Hela细胞的凋亡。
5.上述基因质粒转染Hela细胞后48h,利用流式细胞仪检测细胞周期,发现质粒转染组细胞周期分布变化明显:与对照组相比,转染质粒组G0-G1期细胞比例显著降低,S期和G2-M期细胞比例显著升高(P＜0.05)。说明SS和MSTN基因质粒主要将Hela细胞阻滞在S期。
6.从转染SS和MSTN基因质粒后48h的Hela细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增,检测到SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4和SSTR-5五种受体均能在Hela细胞中表达,说明这5种受体参与SS表达的调控。
7.应用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因(Bax, Bcl-2和p53)的相对表达量,并与对照组相比,发现转染组能显著增加Bax和p53基因mRNA的表达量,降低Bcl-2基因mRNA的表达量(P＜0.05),说明SS和MSTN可能通过调控细胞凋亡相关基因的表达而起作用。上述结果表明,SS和MSTN能够抑制Hela细胞的增殖,其中SS组中pEGS2SS-V和pGS/2SS-IL6-asd(?)的抑制率较高,MSTN组(pEGMS)细胞抑制效果最好,而pEGS/2SS+pEGMS和pEGS2SS-V+pEGMS组的抑制率并没有高于SS和MSTN组。SS和MSTN基因质粒抑制Hela细胞的增殖主要通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡实现的。其中,主要将细胞阻滞在S期,并且还能显著上调Bax和p53基因mRNA的表达量,下调Bcl-2基因mRNA的表达量来诱导细胞凋亡。从转录和表达角度发现pEGS2SS-V和pGS/2SS-IL6-asd在真核细胞中的表达较好,间接表明pEGS2SS-V和pGS/2SS-IL6-asd基因疫苗效果较好,为开发SS基因疫苗奠定基础。
1.应用LipofectamineTM2000脂质体转染方法将SS基因质粒pEGS/2SS、pEGS2SS-V、pGS/2SS-M4GFP-asd、pGS/2SS-IL6-asd和MSTN基因质粒pEGMS及SS和MSTN混合基因质粒pEGS/2SS+pEGMS、pEGS2SS-V+pEGMS转染到Hela细胞中,转染后48h,提取总RNA,反转录后电泳检测到SS和MSTN,说明SS和MSTN基因质粒在Hela细胞中能够正常转录;
2.上述基因质粒转染Hela细胞后48h,用DAPI避光染色、应用共聚焦显微镜亚细胞定位,发现SS融合蛋白在细胞核中表达,MSTN融合蛋白则在细胞核和细胞质中都有表达;
3.上述基因质粒转染Hela细胞后24h、48h、72h和96h,用MTT法检测细胞增殖的情况,并与对照组比较,发现试验组明显抑制细胞生长(P＜0.05),尤其是用pEGMS质粒转染后72h的细胞生长抑制作用最明显。
4.应用Annexin V-APC/7-AAD双染色法检测SS和MSTN基因质粒转染Hela细胞后48h的凋亡情况,并与对照组比较,发现试验组的R5区细胞(即早期凋亡细胞)明显增加(P＜0.05),其中,pEGMS试验组的凋亡率(27.474±2.86％)最高,比对照组高8.15％。表明SS和MSTN基因质粒可促进Hela细胞的凋亡。
5.上述基因质粒转染Hela细胞后48h,利用流式细胞仪检测细胞周期,发现质粒转染组细胞周期分布变化明显:与对照组相比,转染质粒组G0-G1期细胞比例显著降低,S期和G2-M期细胞比例显著升高(P＜0.05)。说明SS和MSTN基因质粒主要将Hela细胞阻滞在S期。
6.从转染SS和MSTN基因质粒后48h的Hela细胞中提取总RNA,逆转录PCR扩增,检测到SSTR-1, SSTR-2, SSTR-3, SSTR-4和SSTR-5五种受体均能在Hela细胞中表达,说明这5种受体参与SS表达的调控。
7.应用实时荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因(Bax, Bcl-2和p53)的相对表达量,并与对照组相比,发现转染组能显著增加Bax和p53基因mRNA的表达量,降低Bcl-2基因mRNA的表达量(P＜0.05),说明SS和MSTN可能通过调控细胞凋亡相关基因的表达而起作用。上述结果表明,SS和MSTN能够抑制Hela细胞的增殖,其中SS组中pEGS2SS-V和pGS/2SS-IL6-asd(?)的抑制率较高,MSTN组(pEGMS)细胞抑制效果最好,而pEGS/2SS+pEGMS和pEGS2SS-V+pEGMS组的抑制率并没有高于SS和MSTN组。SS和MSTN基因质粒抑制Hela细胞的增殖主要通过诱导细胞周期停滞和细胞凋亡实现的。其中,主要将细胞阻滞在S期,并且还能显著上调Bax和p53基因mRNA的表达量,下调Bcl-2基因mRNA的表达量来诱导细胞凋亡。从转录和表达角度发现pEGS2SS-V和pGS/2SS-IL6-asd在真核细胞中的表达较好,间接表明pEGS2SS-V和pGS/2SS-IL6-asd基因疫苗效果较好,为开发SS基因疫苗奠定基础。