论文部分内容阅读
研究目的:本研究探讨放疗后诱导人胰腺癌细胞释放的高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)促进残存胰腺癌细胞去分化的作用及其潜在分子机制,从而为胰腺癌的有效治疗、预防复发提供有效的理论依据。研究方法:(1)应用流式细胞技术分选出三种胰腺癌细胞的CD133阴性细胞亚群。(2)Western blot检测不同分组处理后的胰腺癌细胞(SW1990 CD133-、Patu8988 CD133-、Panc-1 CD133-)的干性相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2、C-MYC、Nanog)及HIFlα蛋白的差异。(3)光学显微镜观察不同分组处理后残存人胰腺癌细胞株(SW1990 CD133-、Patu8988 CD133-)的形态变化及成球能力的差异。(4)应用流式细胞技术测量不同分组处理后人胰腺癌细胞株(SW1990 CD133-、Panc-1 CD 133-)中CD 133阳性细胞的比例。(5)将干扰RNA(sh-TLR2)或者TLR2受体抑制剂与HMGB1在人胰腺癌细胞株(SW1990 CD133-、Patu8988 CD133-)中共培养后应用Western blot检测细胞中干性相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2、C-MYC、Nanog)及HIF1α蛋白表达量。(6)Western b1ot检测HMGB1共培养后人胰腺癌细胞株(SW1990 CD133-)中p-YAP/YAP比率和HIF1α蛋白量。(7)应用核浆分离、免疫荧光、荧光素酶报告基因技术检测HMGB1对YAP及HIF1α入核的影响。(8)应用蛋白免疫沉淀(IP)技术检测HMGB1对YAP及HIF1相互作用的影响。(9)应用染色质免疫沉淀(ChIP)检测HMGB1及缺氧环境对HIF1α与Nanog启动子区结合的影响。研究结果:(1)Western blot 检测发现在人胰腺癌细胞(SW1990 CD133-、Patu8988 CD133-)中生物活性HMGB1(HMGB1)、氧化型HMGB1(D-HMGB1)、还原型HMGB1(R-HMGB1)和放疗上清(SUP)都可以不同程度上促进干性相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2、C-MYC、Nanog)及 HIF1α 的表达,并且 HMGB1 效应最明显,而对Panc-1 CD133-细胞株则没有影响。(2)光学显微镜观察发现人胰腺癌细胞株(SW1990CD133-、Patu8988 CD133-)经HMGB1、D-HMGB1、R-HMGB1、SUP处理后细胞形态发生不同程度变圆,并且细胞成球明显数量增多、体积增大。(3)应用流式细胞技术发现胰腺癌细胞株(SW1990 CD133-)经HMGB1、D-HMGB1、R-HMGB1、SUP处理后CD133阳性比率增高,且差异具有统计学意义,而对Panc-1CD133-没有作用。(4)将干扰RNA(sh-TLR2)或者TLR2受体抑制剂与HMGB1共培养后,胰腺癌的干性相关蛋白(CD133、OCT4、SOX2、C-MYC、Nanog)及HIF1α蛋白没有明显增高。(5)Western blot检测发现与HMGB1共培养后人胰腺癌细胞株(SW1990 CD133-)中p-YAP/YAP比率下降、HIF1α蛋白量增高。(6)应用核浆分离、免疫荧光、荧光素酶报告基因技术发现HMGB1可以使胞浆YAP、HIF1 α蛋白量增加,YAP及HIF1 α细胞核内荧光活性增强,YAP、HIF1 α转录活性增强。(7)应用蛋白免疫沉淀(IP)技术发现HMGB1及缺氧环境促进YAP及HIF1结合。(8)应用染色质免疫沉淀(ChIP)证明HMGB1及缺氧环境可以增强HIF1α与Nanog启动子区结合。结论:(1)人胰腺癌细胞放疗后,细胞上清中被动释放或者主动分泌的HMGB1可以促进放疗残存细胞去分化。(2)细胞上清中HMGB1与胰腺癌细胞膜表面受体TLR2结合促进细胞去分化过程。(3)HMGB1促进人胰腺癌细胞去分化过程中的中心分子为YAP及HIF1α,即HMGB1促进YAP和HIF1α相互结合,并促进两者进核发挥转录活性,启动干性相关蛋白的转录(以Nanog为例),促进肿瘤细胞去分化。