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骨骼肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤常见于溶栓、Fogarty导管取栓、断肢再植、四肢大血管损伤等恢复血流后,是临床亟待解决的重要问题。调动机体内源性保护机制,是减轻I/R损伤最有效的措施。1986年Murry提出缺血预处理"ischemic preconditioning (IPC)"的概念。IPC多次短暂的缺血再灌注增强对其之后的较长时间的缺血的耐受性,减轻I/R损伤,已经被成功的应用于临床和实验工作。然而,由于缺血时间不可预测,限制其临床的应用。2003年Zhao提出了缺血后处理的概念(ischemic postconditioning, I-postC),即在再灌注前立刻给予一次或多次短暂重复心肌I/R,能减轻心肌后续长时间再灌注损伤的现象,该现象在小鼠、大鼠、兔、猪心脏缺血和缺血/再灌注模型上被证实,存在于人类心脏血管重建术后；也存在于脊髓、脑、肠、肝、肺等多种器官组织。这种保护现象可以被短暂的缺氧后处理(hypoxic postconditioning, H-postC)所模拟,具有重要的临床应用价值。外科医生可以在择期手术或者急诊手术时进行I-postC,并且I-postC作为“损伤后策略”易于应用于缺血组织。I-postC的保护机制涉及控制灌注条件、减轻微循环功能障碍、稳定细胞内环境、减轻细胞内钙超载和调动机体内源性应激蛋白(热休克蛋白、自由基清除酶、金属硫蛋白等)的合成上调,阐明其机制具有十分重要的意义。微循环直接影响组织器官血氧供应及存活状态。微循环功能障碍是I/R的损伤性表现,也是加重实质细胞I/R损伤的重要因素,改善微循环功能是减轻组织I/R损伤的关键环节和重要机制。但尚未有研究直接证实I-postC对微循环的影响。钙网蛋白(calreticulin, CRT)是内质网(endoplasmic reticulum, ER)/肌浆网内主要的钙结合蛋白,通过协助蛋白质折叠、维持细胞钙稳态参与细胞凋亡调控。钙信号途径是I/R诱导细胞凋亡的关键途径。细胞内钙离子参与调节I/R损伤。最近的研究结果表明,钙调神经磷酸酶(calcineurin, CaN)及其许多CaN依赖的途径的功能都依赖ER内Ca2+稳态和ER相关的Ca2+的结合伴侣。CaN又称蛋白磷酸酶2B(protein phosphatases 2B, PP2B),是目前发现的唯一受Ca2+/钙调素(calmodulin, CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。CaN是一个包含A(CnA)和B(CnB)亚基的的异源二聚体。CaN在多种细胞过程(包括细胞凋亡、胚胎发育、心脏的生理及代谢调控和癌症)中起着重要作用。环孢素A(cyclosporin A, CsA)与内源性cyclophilin形成复合物,可阻断CaN催化作用,从而抑制细胞因子的转录。既往主要关注CaN在心肌肥大中的作用,近年来发现,CaN参与缺血再灌注损伤,但其作用尚有争议。我们前期研究表明CaN参与I-postC保护心肌作用。基于上述,本工作旨在证实I-postC对于骨骼肌I/R损伤的保护涉及改善微循环的微血管保护和CaN介导的骨骼肌细胞直接保护两个方面。为证实该假说,本工作首先在大鼠后肢I/R损伤模型上证实I-postC对骨骼肌I/R损伤的保护作用及其微血管保护机制；进一步在体外分离培养的大鼠后肢骨骼肌细胞H/R模型上,研究I-postC/ H-postC对骨骼肌细胞H/R损伤的保护作用以及CaN介导H-postC骨骼肌细胞保护分子机制。主要实验方法和结果如下：一、缺血后处理减轻大鼠骨骼肌缺血/再灌注损伤本部分实验旨在观察I-postC/H-postC对骨骼肌I/R或H/R损伤的保护作用。整体实验：健康雄性Wistar大鼠随机分为I/R组、I-postC组、IPC组及假手术组。观察各组血流动力学变化,骨骼肌湿干重比值(wet/dry weight ratio, W/D)测定,骨骼肌组织丙二醛(malondialdehyde, MDA)变化,血浆乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)浓度及骨骼肌形态及超微结构变化。骨骼肌细胞实验：原代培养乳鼠骨骼肌细胞,随机分为(hypoxia/reoxygenation, H/R)组、H-postC组、缺氧预处理(hypoxic preconditioning, HPC)组、正常对照组(CON)。观察各组细胞凋亡率及细胞存活率变化。Western blot分析葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein78, GRP78)、CRT以及CaN表达变化。结果显示：①整体实验：I-postC减轻I/R对心功能的抑制、骨骼肌组织水肿、骨骼肌组织脂质过氧化损伤及血浆LDH浓度,并显著减轻I/R所致骨骼肌结构损伤。I/R诱导GRP78、CRT及CaN表达上升。与I/R组相比,I-postC可诱导GRP78、CRT及CaN表达显著增高。②骨骼肌细胞实验：H/R引起细胞凋亡显著增加,H-postC可显著减轻细胞凋亡率；H/R使细胞存活率降低,H-postC可显著减轻H/R造成的细胞坏死。H/R诱导CRT及CaN表达上升,H-postC可诱导CRT及CaN表达显著增高。二、缺血后处理通过改善微循环减轻大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤第一部分实验证实I-postC可以调动机体内源保护机制,减轻I/R所致骨骼肌损伤。但I-postC是否通过改善微循环减轻骨骼肌I/R损伤?这值得深入研究。本部分实验健康雄性Wistar大鼠随机分为I/R组、I-postC组、IPC组及假手术组。采用监测大鼠骨骼肌微循环改变,以及微血管血流速度及血管内径变化以观察I-postC对骨骼肌微循环的影响,探讨I-postC改善骨骼肌I/R损伤的微血管保护机制。结果显示：①骨骼肌微循环的影响：I/R引起胫前肌微循环障碍,I-postC明显减轻I/R引起的微循环障碍；②微血管血流速度：I/R可引起细静脉流速减慢,I-postC减轻I/R所致细静脉流速减慢；③细动脉内径变化：I/R可引起细动脉挛缩,I-postC减轻I/R所致细动脉挛缩；④细静脉内径变化：I/R可引起细静脉挛缩,I-postC (?)成轻I/R所致细静脉挛缩。三、钙调神经磷酸酶介导缺血后处理减轻大鼠骨骼肌缺血/再灌注损伤前述实验在骨骼肌组织和细胞水平上证实I/H-postC可诱导CaN表达增加,且CaN表达与CRT表达呈正相关,这提示我们CRT上调可能介导了I-postC诱导的CaN表达增加。但CaN活性上调与骨骼肌I/R损伤保护及信号通路的相关机制有待于进一步研究。本实验在Wistar大鼠后肢骨骼肌I/R损伤模型和Wistar乳鼠骨骼肌细胞H/R损伤模型上,观察I-postC (H-postC)损伤保护过程中CaN的变化,探讨CaN参与I-postC (H-postC)保护作用；同时采用CaN抑制剂CsA抑制骨骼肌CaN活性及表达,并采用pcDNA3.1-Myc-His (B) (pCDB)-caN过表达CaN,观察抑制或过表达CaN后后处理对骨骼肌I/R(H/R)损伤的影响。结果发现：①整体实验：CsA显著抑制骨骼肌组织CaN表达及活性,显著抑制I-postC保护作用,骨骼肌水肿加重,MDA及LDH浓度增加,②骨骼肌细胞实验：CsA显著抑制骨骼肌细胞CaN表达及活性,显著抑制H-postC保护作用,细胞凋亡率较H-postC组显著升高,细胞存活率较H-postC组显著降低；转染质粒后,CaN表达及活性明显增强,细胞凋亡率较H-postC组显著降低,细胞存活率较H-postC组显著增高。通过上述分析,得出如下实验结论：①后处理可以调动机体内源性保护机制,减轻I/R(H/R)所致骨骼肌组织(细胞)损伤。②I-postC对于骨骼肌I/R损伤的保护作用,至少部分是通过改善微循环功能实现的,其机制可能涉及减轻I/R造成的细动脉内皮依赖性血管调节功能障碍、后微血管痉挛和微血管无复流现象,并保护微血.管屏障功能。③I-postC可以通过CaN的活化保护大鼠I/R损伤骨骼肌。这些数据揭示了复杂的信号级联参与后处理保护骨骼肌细胞。