研究背景及目的:目前对于手术无法切除的浸润性膀胱癌、术后复发转移的膀胱癌的主要治疗手段是基于铂类化合物的联合化疗。然而传统的化疗药物仅对分裂增殖期的肿瘤细胞具杀伤作用,其中的肿瘤干细胞对传统化疗药物多不敏感。肿瘤干细胞（CSCs,Cancer stem cells）具自我更新、分化的潜能及对外界损伤因素极强的修复潜能,在维持肿瘤的恶性增殖、增强肿瘤的侵袭能力、引起肿瘤的复发、转移以及肿瘤对化疗药耐药等方面起重要作用。因此,如果能有效清除这些具有强的肿瘤形成能力、对传统化疗不敏感的CSCs,就有可能显著提高膀胱癌疗效。Cdc6作为主要的DNA复制起始蛋白之一,高水平的Cdc6不仅仅是肿瘤细胞大量增殖的结果,其本身即具有促进恶性细胞转化的能力,并能影响肿瘤的进展及预后。Cdc6的主要作用是在G1期结合在复制起始位点进行前复制复合体（pre-RC）的组装,启动DNA复制。近来发现,Cdc6可以抑制多种肿瘤细胞中的基因座位INK4/ARF的转录,而INK4/ARF基因座位同时编码p14、p15和p16这3个蛋白从而调控细胞周期。此基因座位的转录下调是CSCs干性的一个重要特征,由此可以推论肿瘤干细胞的干性维持可能与Cdc6抑制此基因座位的转录相关。同时有报道发现Cdc6在人体细胞中参与ATR信号的激活,促进细胞周期检查点通路的激活。而过度增强的DNA损伤修复反应（DDR）是肿瘤干细胞耐药的重要作用机制,DDR的有效完成依赖于ATR参与的检测点通路和各种DNA修复机制的协调进行。去甲斑蝥素（NCTD）可以降解多种肿瘤中Cdc6蛋白,抑制肿瘤细胞的DNA复制、诱导凋亡,在我们课题组之前的研究中去甲斑蝥素单独应用时即对普通的膀胱癌肿瘤细胞有抗肿瘤作用,去甲斑蝥素能够增强顺铂对肿瘤细胞的杀伤作用,具有协同的抗癌作用。那么肿瘤干细胞中Cdc6表达情况如何?INK4/ARF基因座位及ATR通路表达情况如何?为此本课题组运用顺铂（Cisplatin）加压筛选法处理UMUC3细胞富集具有干细胞特性的、对多种化疗药耐药的膀胱癌干样细胞（bladder cancer stem-like cells,BCSLCs）。在此基础上应用去甲斑蝥素作用于此细胞,验证去甲斑蝥素对Cdc6的影响情况,分析探索Cdc6变化对膀胱癌干细胞的干性标志和耐药性的影响及机制,同时验证去甲斑蝥素与顺铂在体内、外的协同抗肿瘤作用。为针对Cdc6在膀胱癌治疗中的临床应用提供实验依据。研究内容、方法和结果:1.膀胱癌干样细胞的富集和鉴定:运用低剂量的顺铂（2 μg/mL）间断处理人膀胱癌UMUC3细胞90天筛选出耐药的膀胱癌UMUC3R细胞后,再运用较高剂量的顺铂（4 μg/mL）连续加压筛选14天,富集到膀胱癌干样细胞（BCSLCs）。通过qPCR检测、流式细胞检测分析筛选后的BCSLCs细胞的干性标志物的表达情况;将筛选后的BCSLCs细胞释放顺铂压力后行划痕实验、transwell实验、体外增殖实验以及体内成瘤实验,检测筛选后的BCSLCs细胞的迁移、侵袭及增殖的潜能;通过CCK-8实验检测BCSLCs细胞对常用几种化疗药的耐药性;Edu实验检测BCSLCs细胞的DNA复制情况。并通过western-blot检测BCSLCs细胞中Cdc6的表达情况。结果显示:顺铂筛选后的膀胱癌干样细胞（BCSLCs）表面的干性标志物CD34,CD133,OCT4,ABCG2及NANOG的表达明显升高,CD133+细胞比例明显升高;释放压力后的BCSLCs细胞的迁移、侵袭、增殖及体内成瘤的能力更强;BCSLCs细胞的对多种化疗药耐药性增强;BCSLCs细胞在维持干性情况下DNA复制是不活跃的。以上结果表明BCSLCs细胞具有CSC特征。同时与UMUC3细胞相比BCSLCs细胞与染色质结合的Cdc6表达更多。2.Cdc6对膀胱癌干样细胞（BCSLCs）干性的影响及机制探索:运用不同浓度的去甲斑蝥素作用UMUC3细胞及BCSLCs细胞后,收取细胞提蛋白,western-blot检测去甲斑蝥素对细胞中与染色质结合的Cdc6表达的影响。qPCR分析去甲斑蝥素对筛选后BCSLCs细胞干性标志物表达的影响。qPCR分析UMUC3细胞、BCSLCs细胞及去甲斑蝥素处理后的BCSLCs细胞中的INK4/ARF基因座位转录的相关基因p16INK4a（p16）、p15及p14ARF（p14）的表达情况。western-blot检测INK4/ARF转录的相关蛋白p16在UMUC3细胞、BCSLCs细胞及去甲斑蝥素处理后的BCSLCs细胞中的表达情况。结果显示:去甲斑蝥素能够有效降解UMUC3细胞及BCSLCs细胞的中于染色质结合的Cdc6蛋白,且随着去甲斑蝥素浓度的增加、Cdc6的降解增加;去甲斑蝥素通过降解与染色质结合的Cdc6蛋白能够显著降低BCSLCs细胞的干性标志（CD133、OCT4及ABCG2）的表达。BCSLCs细胞与UMUC3细胞相比INK4/ARF基因座位转录的p16INK4a（p16）、p15及p14ARF（p14）抑癌基因的mRNA表达水平明显下降,而这种下降能够被去甲斑蝥素所逆转。这种变化及逆转在蛋白水平也得到了验证。3.Cdc6对顺铂敏感性的影响及机制探索:运用去甲斑蝥素及或顺铂作用BCSLCs细胞后,CCK-8实验分析各组BCSLCs细胞的相对细胞活力,以探索在BCSLCs细胞中去甲斑蝥素对顺铂敏感性的影响。运用去甲斑蝥素处理UMUC3细胞及BCSLCs细胞后,处理细胞提取总蛋白及染色质蛋白,western-blot检测染色质中的ATR（ATR-C）蛋白,磷酸化Chk1（p-Chk1）蛋白和磷酸化Cdc25C（p-Cdc25C）蛋白的表达情况,探索去甲斑蝥素对ATR-Chk1-CDC25通路的影响。结果显示:在体外实验中去甲斑蝥素能够增强BCSLCs细胞对顺铂的敏感性;在UMUC3细胞及BCSLCs细胞中去甲斑蝥素均能够通过减少Cdc6-C的表达从而有效抑制ATR-Chk1通路激活。4.动物实验验证去甲斑蝥素是否增强顺铂对膀胱癌干样细胞的作用:用BCSLCs构建裸鼠皮下移植瘤模型。随机分组、进行分组实验,记录去甲斑蝥素、顺铂单独或联合作用对肿瘤生长的影响。并通过免疫组化分析肿瘤组织标本。结果显示:去甲斑蟊素单独作用第九天后,顺铂单独作用第十八天后BCSLCs皮下移植瘤生长速度相对于较空白对照组减慢、对肿瘤有一定的延缓作用,然而肿瘤依然逐渐增大,说明去甲斑蟊素及顺铂单独作用不能有效杀伤BCSLCs形成的肿瘤;联合治疗组（顺铂+去甲斑蝥素）抑制肿瘤生长作用最强,且第18天之后肿瘤的体积较第15天有明显减小。说明去甲斑蝥素能提高顺铂的敏感性,逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药,联合治疗能有效杀伤肿瘤。肿瘤组织免疫组化结果提示,去甲斑蝥素能明显减少肿瘤组织中的C dc6的表达,去甲斑蝥素联合顺铂组肿瘤细胞的DNA损伤显著增强。结论:1.顺铂筛选可以富集到膀胱癌干样细胞。此细胞干性标志高表达,具更强的体内成瘤能力,对多种化疗药耐药,DNA复制相对静止,具有肿瘤干细胞特征。并且具有更强的侵袭、迁移潜能。2.染色质结合的Cdc6（Cdc6-C）能够明显降低基因座位INK4/ARF的转录,下调相关抑癌基因的表达,维持膀胱癌干样细胞的“干性”。3.染色质结合的Cdc6（Cdc6-C）能够通过与ATR结合增强细胞周期检查点通路的激活,激活ATR-Chk1通路,增强肿瘤细胞的DNA损伤修复反应,促进膀胱癌干样细胞对细胞毒性药物的耐药。4.去甲斑蝥素与顺铂对膀胱癌干样细胞BCSLCs在体内、体外均有协同的抗癌作用。其机制为:去甲斑蝥素能够有效清除膀胱癌干样细胞中与染色质结合的Cdc6,继而上调INK4/ARF基因座位的转录,从而逆转其干性;而且去甲斑蝥素通过清除染色质结合的Cdc6、抑制ATR-Chk1通路激活,抑制DNA损伤修复反应,增强顺铂对膀胱癌组织细胞的DNA损伤。