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本文应用基因克隆技术、细胞培养技术、蛋白质分析技术、酶免疫测定技术等构建抑制素与乙肝表面抗原基因的融合表达质粒，用于免疫动物，研究影响抑制素基因免疫效果的因素，探讨抑制素基因免疫对大鼠生殖及生殖内分泌的作用。主要内容如下： 1 卵泡抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒的构建及鉴定 为了构建抑制素基因与乙肝表面抗原基因融合的真核表达质粒，本研究应用Anthwin软件对抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达产物的结构和理化特性进行了分析，从而预测其抗原表位。通过PCR扩增pCMV-S基因中的S基因片段，然后从克隆质粒pUI上酶切获得抑制素α(1-32)基因，再将抑制素α(1-32)片段与S的融合基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(-)；通过酶切、测序鉴定正确后，采用脂质体包裹法将重组质粒转染HeLa细胞使其表达，收集转染3天后的细胞和G418筛选得到的阳性克隆细胞，用SDS-PAGE和竞争ELISA法对其表达产物进行检测。结果发现，抑制素融合基因表达产物二级结构中，Helix占6％，Sheet占39％，Turn占8％，Coil占47％。综合亲水性、抗原性、疏水性等指标，第225-258个氨基酸序列可能包含抑制素的抗原表位。对构建的抑制素重组真核表达质粒进行限制性内切酶酶切和序列分析表明，融合基因片段长793bp，序列与设计完全一致。重组质粒能在HeLa细胞中表达，获得的融合蛋白分子量为29KD。融合蛋白具有抑制素的免疫学活性，能与抑制素抗原肽竞争结合抗抑制素抗体。以上研究结果表明，构建的抑制素融合表达质粒能够在真核细胞中表达，表达的重组蛋白具有抑制素免疫学活性。 2 抑制素基因免疫的免疫反应性及其影响因素 为了分析抑制素基因免疫的免疫反应性及其影响因素，本试验共进行两个系列研究，检测抑制素抗体的P／N值及抗体阳性鼠的比例。系列一将抑制素质粒(pcINH)经脂质体包裹，分0μg(空质粒)、15μg、25μg、40μg四个剂量组，肌肉注射性成熟大鼠，间隔20天，用裸DNA加强免疫一次(n=10)。系列二将抑制素融合质粒(pCIS)分10μg、50μg、100μg三个剂量，以空质粒和生理盐水作对照，肌肉注射经盐酸普鲁卡因处理的性成熟大鼠，间隔20天加强免疫一次(n=18)。对每组中的12只大鼠进行两次加强免疫(n=12)，每次间隔均为20天。结果发现，系列一中pcINH经脂质体介导，两次免疫大鼠可获得50％(13／26)抗抑制素抗体阳性鼠，首次免疫后20天及加强免疫后10天，40μg剂量组的阳性鼠平均抑制素抗体P／N值明显高于15μg和25μg组的抗体P／N值，免疫剂量的增加并没有增加抗体阳性鼠的比例；系列2中pCIS两次免疫经盐酸普鲁卡因处理的大鼠，可获得38.9％(23／54)的抗体阳性鼠，三次免疫后可获得55.6％(20／36)的抗体阳性鼠，增加免疫剂量可提高抗体水平，加强免疫增加了抗体阳性鼠比例和阳性抗体的P／N值。但二次加强免疫后，50μg与100μg组达到了相同的抗体阳性鼠比例。以上研究结果表明，抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒免疫大鼠可产生抗抑制素抗体。综合分析免疫鼠的抗抑制素抗体水平及阳性鼠的抗体水平，发现抑制素质粒pcINH经脂质体介导免疫大博士论文:抑制素基因免疫对大鼠生殖及生殖内分泌的作用鼠，40“g剂量免疫产生的抗体水平最高;抑制素融合表达质粒pCIS免疫经盐酸普鲁卡因处理的大鼠，100似g剂量免疫产生的杭体水平最高。增加抑制素基因免疫的次数可增强抑制素基因免疫的效果。但免疫剂量的增加并不一定能增加抗体阳性鼠的比例.3抑制素基因免疫对大鼠生殖及生殖内分泌的影响 为了探讨抑制素基因免疫对大鼠生殖及生殖内分泌的作用，本试验进行两个系列的研究.系列一用。、15、25、40 09的抑制素质粒(PcINH)经脂质体包裹免疫大鼠，20天后以相同剂量的裸DNA加强免疫一次(n= 10)，观察大鼠的卵泡发育(n二5)。系歹，J二用10、50、100“g的抑制素融合质粒(pCIS)和50，gpenNA3.l、100卜L生理盐水免疫经盐酸普鲁卡因处理的大鼠(n=18)，20天后加强免疫一次，观察大鼠卵泡发育(n=6);对每组中的12只大鼠进行两次加强免疫，观察大鼠卵泡发育(n=6)及产仔情况(n=6).结果发现，PcINH免疫大鼠，40”g免疫组的成熟卵泡发育数比对照组增加了6.5个勿<0.05)，pcIS免疫大鼠，1 00料g剂量组两次和三次免疫分别使成熟卵泡发育数比对照组多6.9和7.5个沙<0 .05)。pcIS两次免疫后，100”g剂量组卵泡发育程度明显提高勿<0 .05)。pcIS三次免疫后大鼠成熟卵泡发育数比两次免疫后明显提高(35.2土6.7 VS 31.0士3.9，尸<0.05)。pCIs三次免疫大鼠后，免疫组和阳性组的胎盘数和窝产仔数分别多于对照组与阴性组(p>0.05)。pe取H两次免疫、pcls两次免疫和三次免疫后阳性鼠的杭体水平(P加值)与卵巢成熟卵泡发育数的相关系数分别为0.13，0.43，0.45，pcls三次免疫后的阳性鼠杭体水平与胎盘数的相关系数为0.77。Pc取H首次免疫10天后的FsH水平在阳性鼠与阴性鼠之间有显著差异勿<0 .05)，pcls免疫大鼠，动情期血装和产后血浆FsH水平高于对照组，杭体阳性鼠的血浆FSH水平高于阴性鼠(P>0.05)。Pc州H两次免疚大鼠后的血浆雌二醇水平有所升高(p>0