一、研究的目的及意义自杀基因疗法因存在旁杀伤效应的独特机制而成为具有广泛应用前景的肿瘤治疗新方法,增强自杀基因治疗的效果成为研究热点。课题组前期研究表明,体外较低浓度薯蓣皂苷可促进人肾癌786-0细胞缝隙连接的通讯功能,但其作用机制尚未明确。本研究在确定薯蓣皂苷(Dio)具有对小鼠B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用后,通过构建促进/抑制缝隙连接通讯(GJIC)功能的细胞模型,以进一步研究可能是薯蓣皂苷对自杀基因治疗系统发挥增效作用的重要机制——缝隙连接机制。二、方法(一)薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的影响1MTT法检测0-8μMDio对B16细胞生长的影响,以确定用于研究GJIC功能的Dio浓度。2预标记双染料传输流式细胞术检测0-4μMDio对B16细胞GJIC功能的影响,用流式细胞仪分析预先以药物处理及染色标记细胞的缝隙连接功能,检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价缝隙连接功能的指标；比值越大表示细胞间形成的缝隙连接细胞间通讯功能越强。3qPCR检测0-4μMDio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26基因转录的影响,结果用2-ΔΔct法进行相对定量分析Cx43、Cx32、Cx26mRNA水平。4Western Blot检测0-4μMDio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达的影响,对图像进行扫描和分析。(二)薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用1MTT法检测杀伤效应。将B16与B16HSV-tk细胞按3：2比例混合接种到96孔板。混合细胞分为空白组、RA阳性对照组、GCV组、Dio组、Dio+GCV联合组。培养24h后根据分组给药,48h后以MTT法检测各给药组杀伤效应。2Annexin V单染法检测细胞凋亡。将B16与B16HSV-tk细胞按3：2比例混合接种到6孔板。混合细胞分为空白组、RA阳性对照组、GCV组、Dio组、Dio+GCV联合组。培养24h后根据分组给药,48h后AnnexinV单染,流式细胞仪检测各给药组细胞凋亡情况。(三)阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响1构建pLVmCterry-Cx43慢病毒载体质粒：设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应后扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对Cx43PCR扩增产物及pLVmCherry质粒分别进行双酶切,T4DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α,提取质粒。重组质粒电泳及测序鉴定。所构建的质粒命名为pLVmCherry-Cx43。2构建pLVmCherry-Cx43G21R、pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒：利用定点突变技术,设计包含一对突变位点的引物,以前期构建的pLVmCherry-Cx43为模版扩增质粒全长,产物用Dpn I消化后转化大肠杆菌DH5α。挑单克隆测序鉴定,所构建基因定点突变阳性克隆质粒命名为pLVmCherry-Cx43G21R、pLVmCherry-Cx43G138R。3构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株：提取pLVmCherry-Cx43、pLVmCherry-Cx43G21R, pLVmCherry-Cx43G138R重组慢毒质粒,以293T细胞包装病毒感染B16细胞,5d后观察mCherry表达。所获细胞放大培养后用BD公司FACSJazz型流式细胞仪分选红色荧光细胞,获得稳定过表达细胞株。Western Blot法检测所获稳定株Cx43蛋白表达情况。4荧光示踪法分析缝隙连接功能：供体细胞用5μM的Calcein-AM孵育30min。将供体细胞按1：100比例接种到受体细胞上,继续培养6小时,待形成稳定的GJ后,用荧光显微镜观察分析GJIC功能。实验组与对照组平均每个供体细胞周围发绿色荧光的受体细胞个数的比值,作为评价GJ功能的指标。5MTT法检测过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响：将B16与B16HSV-tk细胞按3：2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组、GCV联合薯蓣皂苷组;B16-Cx43与B16HSV-tk按3：2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组;B16-Cx43G21R与B16HSV-tk、B16-Cx43G138R与B16HSV-tk分别按3：2比例混合接种到96孔板,混合细胞分为空白组、GCV组、GCV联合薯蓣皂苷组。上述混合细胞培养24小时后加药,终浓度为GCV25μM、Dio4μM,每孔培养液总体积200μl,置于37℃、体积分数5%CO2的培养箱培养。48小时后MTT法检测杀伤效应。三、结果(一)薯蓣皂苷对小鼠黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的影响1MTT法检测不同浓度Dio对B16细胞生长的影响：0-4μM Dio处理B16细胞48小时对其生长无明显影响。2预标记双染料传输流式细胞术检测0-4μM Dio对B16细胞GJIC功能的影响：与对照组相比,B16细胞经各浓度梯度Dio处理48小时后,单绿荧光细胞与双阴细胞的比值随加药浓度的升高而增大,表明体外较低浓度Dio能有效促进B16细胞缝隙连接功能,且存在明显的剂量效应关系。3qPCR检测不同浓度Dio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26基因转录的影响：Dio处理细胞48小时,对Cx43及Cx32的RNA转录无明显影响、对Cx26的RNA转录有明显促进作用；4μM Dio处理细胞48小时,明显促进Cx43及Cx32的RNA转录、对Cx26的RNA的转录有明显抑制作用。4Western Blot检测Dio对B16细胞Cx43、Cx32、Cx26蛋白表达的影响：与对照组相比,经0-4μM Dio处理48小时后,Cx43与Cx26蛋白的表达量随加药浓度的升高而增加、Cx32的表达量随加药浓度的升高而减少,表明Dio能有效促进B16细胞缝隙连接蛋白Cx43及Cx26的表达、抑制Cx32的表达。(二)薯蓣皂苷对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的增效作用1MTT实验表明联合用药组对60%B16与40%B16/tk混合细胞的抑制率明显高于其他组,25μM GCV+2μM Dio组实际抑制率为49.2%,25μMGCV+4μMDio组实际抑制率为56.5%显著高于理论抑制率(32.4%,35.3%),且与25μM GCV组抑制率存在显著统计学差异；金正钧Q值分别为1.52、1.60,均大于1.15,说明Dio与GCV具有协同增效作用,Dio对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统具有增效作用。2AnnexinV单染检测细胞凋亡结果显示,联合用药组的细胞早期凋亡率均高于单药组,其中以4μM Dio+25μM GCV组细胞早期凋亡率最高(61.09%)。AnnexinV单染法检测各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致。(三)阻断缝隙连接功能对薯蓣皂苷在自杀基因治疗系统中增效作用的影响1构建pLVmCherry-Cx43’慢病毒载体质粒：对质粒pLVmCherry-Cx43的DNA酶切电泳,可见约8kb(空载体pLVmCherry大小8.2kb)和1kb大小两条带,符合预期结果；pLVmCherry-Cx43中Cx43测序结果与NM000165序列完全一致。2构建pLVmCherry-Cx43G21R、 pLVmCherry-Cx43G138R基因定点突变慢病毒载体质粒：对质粒pLVmCherry-Cx43-G21R、pLVmCherry-Cx43-G138R的DNA酶切电泳,均可见约8kb和lkb大小两条带；重组质粒pLVCx43-mCherry-G21R测序结果显示,其按引物设计第61位鸟嘌呤突变为腺嘌呤,其余序列完全一致；pLVmCherry-Cx43-G138R测序结果显示,其按引物设计第412位鸟嘌呤突变为腺嘌呤、第414位胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤,其余序列完全一致。3构建过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞株：将重组质粒包装病毒,感染B16细胞5d后荧光显微镜下即可见细胞有mCherry表达；mCherry的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强。Western Blot检测稳定株缝隙连接蛋白,过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R的B16细胞Cx43蛋白表达量明显高于对照组。4荧光示踪法分析缝隙连接功能：过表达野生型Cx43后B16细胞间钙黄绿素传递较正常组增强,过表达突变型Cx43G21R、Cx43G138R后B16细胞间钙黄绿素传递缝隙连接功能较正常组减弱。5MTT法检测过表达野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统的影响：混合细胞培养24小时、48小时生长情况无明显差异；培养72小时,B16-Cx43混合组生长情况较其他混合细胞缓慢。GCV组B16与B16HSV-tk混合细胞抑制率为27.46%,B16-Cx43与B16HSV-tk混合细胞抑制率为46.32%(P<0.05vs B16与B16HSV-tk混合细胞),B16-Cx43G21R与B16HSV-tk混合细胞抑制率为25.07%, B16-Cx43G138R混合细胞抑制率为26.44%；GCV+Dio联合组B16与B16HSV-tk混合细胞抑制率为54.78%,B16-Cx43G21R与B16HSV-tk混合细胞抑制率为32.08%(P<0.05vs B16与B16HSV-tk混合细胞),B16-Cx43G138R混合细胞抑制率为33.21%(P<0.05vsB16与B16HSV-tk混合细胞)。GCV对混合细胞含过表达野生型Cx43的B16细胞株抑制率,高于混合细胞含普通B16细胞组；Dio与GCV联合组,对混合细胞含过表达突变型Cx43G21R或过表达突变型Cx43G138R的B16细胞株抑制率,低于含普通B16细胞组,且与单纯GCV组无明显统计学差异。四、结论与展望(一)0-4μM Dio处理B16细胞48小时对其生长无明显影响；体外低浓度Dio对B16细胞GJIC功能具有促进作用,且呈量效关系。其作用机制可能由于Dio可促进部分Cx蛋白的表达,从而促进GJIC功能。(二)Dio对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统具有增效作用。(三)成功构建野生型Cx43、突变型Cx43G21R、突变型Cx43G138R慢病毒载体质粒；获得稳定过表达野生型Cx43、过表达突变型Cx43G21R以及过表达突变型Cx43G138R的B16细胞株。过表达野生型Cx43可促进B16细胞株GJIC功能,过表达突变型Cx43G21R, Cx43G138R可抑制其GJIC功能。(四)旁杀伤效应的缝隙连接机制,是Dio发挥对B16HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统增效作用的重要机制。本研究将中药单体与自杀基因联合应用,在证实体外较低浓度薯蓣皂苷具有促进B16细胞GJIC功能、可增强自杀基因治疗系统旁杀伤效应的基础上,构建过表达Cx43功能正常及功能缺陷细胞株,通过促进及阻断缝隙连接通讯的方式进一步研究自杀基因疗法旁杀伤效应的缝隙连接机制,为中药方药对自杀基因治疗系统增效作用及机制等相关研究奠定更好的实验基础。