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目的:丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT(也被称为PKB),是细胞生长的中心调控因子。AKT信号参与细胞体内多种信号途径,具有广泛的生物学效应,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、血管生成以及细胞外基质的降解等相关,它的超活化导致肿瘤的发生、发展以及化疗耐受。之前的研究表明,磷酸化酶PHLPP能够对AKT-Ser473位点去磷酸化负调控AKT的活性。FKBP5作为骨架蛋白,可促进PHLPP-AKT蛋白相互作用,并参与PHLPP介导的AKT-Ser473去磷酸化,FKBP5通过调控AKT信号通路中起到了抑制肿瘤发生的作用。但是,目前关于FKBP5的调控机制还不是很清楚。在本文中,我们主要寻找FKBP5的调控蛋白,研究其对FKBP5的调控机制以及该蛋白是如何通过FKBP5-AKT通路调控肿瘤的生长和对化疗药物的耐受性。方法:(1)通过串联亲和纯化及质谱分析(TAP-MS)寻找FKBP5的互作蛋白。(2)利用病毒感染的方法建立FKBP5互作蛋白的过表达或敲低细胞稳定株,免疫印迹法检测FKBP5的蛋白表达及稳定性。(3)利用体内和体外泛素化实验,检测目标蛋白对FKBP5的泛素化调控情况。(4)利用病毒感染的方法建立FKBP5及其互作蛋白的单敲低与双敲低细胞稳定株,免疫印迹法检测AKT及其下游蛋白的磷酸化变化情况。(5)利用MTT实验、软琼脂实验检测目标蛋白对胰腺癌细胞生长的影响。(6)建立动物模型,检测目标蛋白对肿瘤生长的影响。(7)利用免疫组化技术检测FKBP5、P473-AKT和目标蛋白在组织芯片中的表达情况。(8)检测目标蛋白如何影响胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。结果:(1)运用串联亲和纯化及质谱分析发现了FKBP5的互作蛋白去泛素化酶USP49,并利用免疫共沉淀实验验证了二者的相互作用。(2)敲低USP49能够下调FKBP5的蛋白水平,FKBP5的蛋白稳定性也随之降低。(3)敲低USP49增加FKBP5的泛素化水平,过表达USP49则降低FKBP5的泛素化水平。(4)稳定敲低USP49后,AKT及下游蛋白的磷酸化水平增加。但是在敲低FKBP5的基础上再敲低USP49,AKT及下游蛋白的磷酸化平便不再变化。(5)稳定敲低USP49能够促进胰腺癌细胞的增殖;但是在敲低FKBP5的基础上再敲低USP49,则不再进一步促进;(6)体内实验表明,稳定敲低USP49能够促进小鼠肿瘤的生长;在敲低USP49基础上再过表达FKBP5,肿瘤的生长能力又恢复正常。(7)免疫组化结果表明,USP49与FKBP5在胰腺癌组织中表达呈正相关,而USP49和P473-AKT表达呈负相关。(8)USP49能够增加胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。结论:本文发现去泛素化酶USP49,作为一个新的AKT信号通路调控因子,能够去泛素化稳定FKBP5,加强PHLPP介导的AKT的去磷酸化调节。此外,USP49能够抑制胰腺癌细胞增殖,促进胰腺癌细胞对化疗药物的敏感性。临床上,USP49在胰腺癌组织样本中低表达,且与FKBP5表达呈正相关而与AKT-Ser473磷酸化的表达呈负相关。本文整体表明,USP49作为AKT通路新的调控因子,在胰腺癌肿瘤发生和化疗耐药方面发挥非常重要的作用。