补虚化瘀组方中药的临床研究及基于caspase-3/9内源性信号通路调控GCDC对HiBEC损伤的作用

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lobohzs
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目的:(1)临床研究:回顾性研究评价补虚化瘀组方中药治疗PBC气虚血瘀证的临床疗效;(2)实验研究:建立模拟PBC患者HiBEC凋亡的细胞模型,探讨补虚化瘀组方中药基于caspase-3/9内源性凋亡信号通路调控GCDC介导的HiBEC凋亡的机制,以期为临床提供可靠的实验依据。方法:(1)以2010年以来来自龙华医院门诊及住院的PBC气虚血瘀证患者为研究对象,分为对照组与治疗组,对照组口服UDCA,治疗组在口服UDCA的基础上加服补虚化瘀组方中药早晚各一次,时间节点为6个月和12个月。观察比较两组UDCA应答率及中医症状的改善情况。(2)鉴于前期补虚化瘀组方中药的临床疗效,本实验将以GCDC作为诱导剂,HiBEC为载体,建立模拟PBC胆管上皮细胞凋亡的细胞模型,以UDCA作为阳性对照药,设置浓度梯度,探索补虚化瘀组方中药调控GCDC介导的HiBEC损伤引起凋亡的作用机制。结果:(1)依据巴塞罗那标准,用药6个月后,治疗组的UDCA应答率为86.4%高于对照组60.0%,P=0.044,差异具有统计学意义(P<0.05);12个月后两组应答率比较,P=0.167,差异无统计学意义(P>0.05)。依据Ehime标准,用药6个月后,治疗组UDCA应答率与对照组差异无统计学意义(P>0.05),12个月后,治疗组应答率81.8%高于对照组52%,P=0.031,差异具有统计学意义(P<0.05)。两组用药6个月前后ALT、AST、GGT、ALP指标均得到有效改善,P<0.001,差异均具有统计学意义(P<0.05);对两组用药后进行比较,6个月后发现治疗组ALP的改善优于对照组,P=0.009,12个月后治疗组GGT的恢复优于对照组,P=0.041,差异均具有统计学意义(P<0.05)。两组Ig G均较之前得到改善,对照组Ig G用药6个月后,P=0.013,治疗组Ig G用药12个月后改善,P=0.017,差异均具有统计学意义(P<0.05);两组Ig M用药12个月后均得到改善,对照组P=0.018和治疗组P=0.032,差异均具有统计学意义(P<0.05);两组免疫指标之间相比差异无统计学意义(P>0.05),尚不能认为治疗组效应优于对照组。依照尼莫地平法公式对两组前后的症状评分进行分析统计,6个月后,对照组显效8例,有效10例,无效7例,显效率及有效率共72%,治疗组显效15例,有效4例,无效3例,显效率及有效率共86.4%,两组比较P=0.023,差异具有统计学意义(P<0.05);12个月后,对照组显效11例,有效9例,无效5例,显效率及有效率共80%,治疗组显效18例,有效3例,无效1例,显效率及有效率共95.5%,两组比较P=0.008,差异具有统计学意义(P<0.05);其中6个月后,瘙痒症状的改善,对照组12例有效,治疗组17例有效,P=0.038,差异具有统计学意义(P<0.05);12个月后,神疲乏力的改善,对照组15例有效,治疗组19例有效,P=0.044,差异具有统计学意义(P<0.05)。其余症状的改善两组差异无统计学意义(P>0.05)。(2)模型的建立:CCK-8和FCM结果:HiBEC在1.0m M/L GCDC作用下凋亡以早期凋亡为主,且随GCDC浓度升高凋亡率呈明显上升趋势。0.5 m M/L GCDC组凋亡率为8.41±1.04(%),1.0 m M/L GCDC组凋亡率16.2±1.26(%)、1.2 m M/L GCDC组凋亡率33.86±0.65(%),与空白组相比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。WB结果:1.0 m M/L和1.2 m M/L的GCDC组cleaved-caspase 3上调,与空白组相比较差异具有统计学意义(P<0.05);其中1.2 m M/L GCDC组Caspase-9上调与空白组相比较差具有统计学意义(P<0.05);1.0 m M/L GCDC组cleaved-caspase 9上调,与空白组相比较差具有统计学意义(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2在各组中均存在不同程度表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.05);此外1.0 m M/L、1.2 m M/L GCDC能引起PDC-E2的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。TCM作用机制:CCK-8和FCM结果:与模型组凋亡率16.21±1.26(%)相比较:高浓度0.2 mm/L UDCA组凋亡率增加可达28.82±0.85(%),差异具有统计学意义(P<0.05);中、低浓度UDCA组,TCM高、中、低三个浓度组及联合组均可不同程度降低HiBEC凋亡率,差异具有统计学意义(P<0.05);中、低浓度UDCA组凋亡率比较,中浓度0.02 mm/L UDCA组具有更好抑制HiBEC凋亡的作用,差异具有统计学意义(P<0.05);高、中、低浓度TCM三组组间进行比较,效应排序:中浓度TCM组>高浓度TCM组=低浓度TCM组,差异均具有统计学意义(P<0.05);中浓度0.02 mm/L UDCA组与中浓度1 mg/ml TCM组相比较,差异无统计学意义(P>0.05);联合组与0.02mm/L UDCA组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。WB结果:与模型组比较:Caspase-3总蛋白的表达情况:中浓度1mg/ml TCM组差异具有统计学意义(P<0.05);活化cleaved-caspase 3:高浓度0.2 mm/L UDCA组>联合组=中浓度0.02 mm/L UDCA组,差异具有统计学意义(P<0.05);Caspase-9总蛋白的表达情况:联合组>中浓度1mg/ml TCM组=中浓度0.02 mm/L UDCA组,差异具有统计学意义(P<0.05);活化cleaved-caspase 9:联合组>中浓度1mg/ml TCM组=中浓度0.02 mm/L UDCA组>高浓度0.2 mm/L UDCA组=低浓度0.002 mm/L UDCA组,差异具有统计学意义(P<0.05);Bcl-2:高、中、低三个浓度TCM组及联合组均可以不同程度上调Bcl-2,差异均具有统计学意义(P<0.05),中浓度1mg/ml TCM组=联合组>高浓度5mg/ml TCM组。结论:(1)补虚化瘀组方中药可在一定程度上提高气虚血瘀型PBC患者的UDCA应答进程,并促进肝功能ALP、GGT等的恢复,调节免疫,改善患者的临床症状。(2)当GCDC浓度为1.0m M/L时可以建立模拟PBC患者胆管上皮细胞凋亡的细胞模型。实验证实TCM对GCDC介导的HiBEC损伤的细胞凋亡模型具有一定的调控作用,表现在下调caspase-3/9及其活化cleaved形式的表达,并且对线粒体相关的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达具有一定的上调作用,与UDCA联合作用的效应更为突出。因而TCM调控HiBEC凋亡的作用机制可能与caspase-3/9内源性途径密切相关。
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