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研究目的及背景子宫内膜异位症(Endometriosis,EM),简称内异症,是正常的子宫内膜腺体和间质出现在宫腔以外的部位,其发病机制及病理生理过程尚不明确,也无特异的实验室检查明确诊断。因此,本研究的第一部分通过对比EM患者和健康体检者血清糖类抗原125(Carbohy-drate Antigen 125,CA125)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(Neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR)差异,探讨CA125和NLR与子宫内膜异位症的相关性。第二部分,通过分析NOD1-2在异位和在位子宫内膜间充质干细胞表达差异,探讨NOD1-2表达异常参与异位病灶的发生发展,借此补充免疫和炎症因素致内异症的发生机制。异位病灶干细胞起源学说是一种新的EM发病机制,干细胞自我更新能力强,参与月经后子宫内膜再生,异位病灶处可见到功能异常的干细胞,但干细胞如何参与内异症的发生尚不明确。在位和异位子宫内膜间充质干细胞生物学特性是否有差异,尚有争议。研究表明内异症是一种慢性炎症反应性疾病,核苷酸结合寡聚化结构域样蛋白1-2(nucleotide-binding oligomerization domain like receptor1,NOD1-2)是一种新的模式识别受体,可识别多种病原体相关分子模式,启动固有免疫应答,刺激巨噬细胞活化和炎症信号转导,参与多种疾病的发生发展。材料与方法1.选取2017年11月至2018年12月在河南省人民医院妇科行择期手术的EM患者100例为内异症组,选同期健康体检者100例为对照组,对比两组血清CA125和NLR表达水平,分析CA125和NLR与子宫内膜异位症的相关性。2.同期收集43例EM囊壁组织,16例正常子宫内膜组织(endometrium,EN),12例子宫内膜异位症患者在位子宫内膜组织(eutopic-EM,eut-EM)和异位内膜组织(ectopic-EM,ect-EM)。通过实时荧光定量PCR(Real Time quantitative PCR,qPCR)和免疫组化(immunohistochemy,IHC)检测NOD1、NOD2在在位和异位子宫内膜组织中的表达差异。将组织通过胶原酶消化获得在位和异位子宫内膜基质细胞,培养后经流式细胞术分析在位和异位子宫内膜基质细胞表达干细胞标记物CD44、CD73、CD140b、CD146、SUSD2和CD271的阳性率以鉴定间充质干细胞纯度;经三系分化实验验证在位和异位子宫内膜基质细胞的成脂肪、成骨和成软骨分化能力。经克隆形成实验鉴定在位和异位子宫内膜基质细胞克隆斑形成能力;用qPCR检测NOD1在异位和在位子宫内膜基质细胞中的转录水平;用CCK8、Transwell实验、凋亡实验和克隆形成实验等技术检测在位子宫内膜间充质干细胞(eutopic-mesenchymal stem cell,eut-MSC)和异位子宫内膜间充质干细胞(ectopic-mesenchymal stem cell,ect-MSC)增殖、克隆形成、侵袭迁移和凋亡能力有无差异,因这些功能差异可能是异位病灶形成的原因。上调或抑制NOD1表达,观察eut-MSCs和ect-MSCs的增殖、克隆形成、侵袭迁移和凋亡情况。用qPCR检测eut-MSCs和ect-MSCs侵袭相关基因MMP2、MMP3,血管生成相关因子VEGFA、IL-8及抗炎细胞因子TGF-β1转录水平,探究在位和异位子宫内膜微环境是否存在差异。结果1.内异症组血清CA125和NLR水平均高于对照组,有统计学差异;随着r-AFS分期增加,血清CA125和NLR水平呈升高趋势。2.qPCR结果显示EM组NOD1 m RNA表达水平明显高于EN组,ect-EM组NOD1m RNA表达较eut-EM高,两组均有统计学差异(P<0.05)。EM组NOD2 m RNA表达水平较EN组稍高,ect-EM组NOD2 m RNA表达较eut-EM稍高,两组均无统计学差异(P>0.05)。免疫组化结果显示:NOD1在异位病灶组织呈中表达,在正常子宫内膜组织中不表达,且NOD1主要表达于异位子宫内膜间质细胞胞浆。3.流式分析结果显示:在ect-MSCs和eut-MSCs中CD44、CD73、CD146和CD140b平均阳性百分比在90%以上;SUSD2在同种细胞的不同个体间表达差距较大,平均阳性百分比占50%左右;ect-MSC及eut-MSCs均低表达CD271,且阳性百分比小于10%。4.三系分化实验结果显示:正常和异常子宫内膜基质细胞经过21天分化诱导培养后,均可成向成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞分化。5.CCK8结果显示:eut-MSCs较ect-MSCs增殖能力显著,有统计学差异。6.Tri-DAP促进eut-MSCs增殖呈时间和浓度依赖性。1ng/m L、10ng/m L、100ng/m L、1μg/m L、10μg/m L浓度梯度的Tri-DAP分别刺激eut-MSCs,24h后开始促进细胞增殖,浓度为1μg/m L时有统计学差异(P<0.05),浓度为10μg/m L时,不再促进细胞增殖;48h后,均可促进细胞增殖且有明显统计学差异(P<0.05),浓度为1μg/m L促进增殖效果最明显,10μg/m L仍可促进增殖但效果下降;72h后,100ng/m L促增殖效果最明显,随Tri-DAP浓度增高,细胞增殖效果下降。ML130抑制ect-MSCs增殖也呈时间和浓度依赖性,0、0.28μm/m L、0.56μm/m L ML130分别刺激ect-MSCs,24h后无明显抑制作用;48h后0.56μm/m L ML130抑制ect-MSCs增殖效果最明显,有统计学差异(P<0.05);72h后无明显抑制作用。7.克隆形成实验结果显示10ng/m L Tri-DAP刺激eut-MSCs,克隆斑数量最多,但与对照组相比无统计学差异;0.56μm/m L ML130刺激ect-MSCs,克隆斑数量下降,与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。8.Transwell实验结果显示eut-MSCs较ect-MSCs侵袭及迁移能力增加,有统计学差异(P<0.05)。9.ML130抑制ect-MSCs侵袭及迁移能力呈浓度依赖性,浓度为0.28μm/m L对细胞侵袭迁移能力无明显影响,浓度为0.56μm/m L时可同时抑制ect-MSCs侵袭迁移能力,有明显统计学差异(P<0.05)。10.qPCR结果显示ect-MSCs组NOD1、IL-8和VEGFA m RNA表达水平较eut-MSCs组升高,而MMP2、MMP3和TGF-β1 m RNA较eut-MSCs下降。11.凋亡实验结果显示ect-MSCs与eut MSCs凋亡率无差异。不同浓度梯度0.28μm/m L、0.56μm/m L ML130分别刺激ect-MSCs 24h和48h后均未见明显凋亡细胞,抑制NOD1对ect-MSCs的凋亡无明显影响(P>0.05)。结论血清CA125和NLR水平与子宫内膜异位症及r-AFS分期呈正相关性。两者联合检测,EM检出的阳性率更高。NOD1主要表达于异位子宫内膜组织,NOD2在正常和异位子宫内膜组织中表达无差异。Eut-MSCs较ect-MSCs增殖、侵袭迁移能力增加,凋亡能力无差异;1μg/m L Tri-DAP刺激48h促进eut-MSCs增殖最明显;0.56μm/m L ML130抑制ect-MSCs增殖、侵袭迁移和克隆形成的能力较强,但对细胞凋亡率无明显影响。Ect-MSC表达NOD1、IL-8、VEGFAm RNA水平升高,而MMP2、MMP3和TGF-β1转录水平下降。NOD1在参与eut-MSCs和ect-MSCs固有免疫应答中发挥重要作用。