近年来,随着社会的发展和人们生活方式的改善,糖尿病发病率日益升高,严重威胁着人类的健康和生活质量。二甲双胍作为2型糖尿病患者的一线药物被应用多年,一直被广大学者所关注。二甲双胍的作用机制主要是改善胰岛素抵抗,作用的靶点主要在肝脏,特别是抑制肝糖异生,降低空腹血糖方面已被大家所熟悉。近年来对二甲双胍的研究越来越深入,对其在调节血糖方面的作用机制的认识越来越丰富。另外,随着对二甲双胍药理作用的深入了解,二甲双胍改善糖代谢以外的作用也更多地被认识,如减肥、抗肿瘤、抗衰老等。因此,也需要不断探索二甲双胍作用的新机制。细胞信号转导抑制因子3（Socs3）是细胞因子信号抑制物家族成员之一。有研究表明,Socs3与胰岛素抵抗密切相关,且二甲双胍可通过抑制Socs3的表达改善胰岛素抵抗。但是,二甲双胍通过作用于Socs3改善胰岛素抵抗的具体作用机制不清楚。lncRNA是一种非编码RNA分子,长度超过200 bp,一般无蛋白编码能力,保守性较低。随着对lncRNA的深入了解,认识到该类小分子物参与了染色质修饰、转录激活、核内运输等调控过程,在人类炎症、肿瘤性疾病中起着重要作用。近年的研究表明,lncRNA在糖脂代谢调节中也扮演了重要角色。因此,二甲双胍是否通过调节某种lncRNA来进一步调节Socs3的表达,进而改善胰岛素抵抗目前还不清楚,需要深入研究。本研究首先采用高脂饮食胰岛素抵抗动物模型,给予二甲双胍干预,取受试小鼠肝脏组织进行高通量测序分析,从差异表达的lncRNA和mRNA中寻找二甲双胍改善胰岛素抵抗可能作用的新靶点。然后采用建立胰岛素抵抗细胞模型,通过细胞转染技术进一步探讨二甲双胍是否可以通过调节lncRNA的表达,作用于Socs3改善胰岛素抵抗。最后,通过临床研究观察,Socs3及炎症因子CRP、IL-6等与胰岛素抵抗的关系,及二甲双胍对糖尿病患者糖脂代谢、Socs3及炎症因子表达影响,从而为发现二甲双胍改善胰岛素抵抗新的作用机制提供依据。第一部分二甲双胍对高脂饮食胰岛素抵抗小鼠肝脏lncRNA和mRNA表达谱的影响目的:通过对二甲双胍干预的胰岛素抵抗小鼠肝脏组织进行高通量测序分析,分析差异表达的lncRNA和mRNA,寻找二甲双胍改善胰岛素抵抗新的调节靶点。方法:36只雄性C57BL/6J小鼠,适应性喂养1周后随机分为对照组（CON）12只和高脂组（HFD）24只。高脂组小鼠连续给予8周高脂饮食,随后行腹腔注射糖耐量实验（IPGTT）并计算葡萄糖曲线下面积（AUC）,验证胰岛素抵抗模型是否建立。将HFD组小鼠随机选取12只给予二甲双胍200 mg/kg/d灌胃（HFD+MET）,CON组和HFD组给予相同体积的生理盐水灌胃。6周末,再次行IPGTT试验。眼球取血离心后取血清,用酶标仪比色法测血脂水平,酶联免疫吸附法（ELISA）测空腹胰岛素水平。留取肝脏组织称重,并观察不同组肝脏组织形态学变化。小鼠胰岛素抵抗模型建立后,每组（CON、HFD、HFD+MET）随机选取4只小鼠取肝脏组织进行高通量测序分析,筛选出差异表达的lncRNAs和mRNAs,对差异表达的mRNAs进行GO和KEGG富集分析,找出二甲双胍改善肝脏胰岛素抵抗新的靶点和信号转导通路。通过实时聚合酶链反应（RT-q PCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测新的靶点蛋白和调节通路中关键分子的表达水平。结果:1.高脂饮食后小鼠胰岛素抵抗模型的建立与CON组相比,HFD组小鼠体重明显升高,从第2周开始差异有统计学意义。高脂饮食8周后行IPGTT试验,与CON组相比,HFD组小鼠血糖水平及葡萄糖曲线下面积显著升高,提示小鼠糖耐量异常,并出现胰岛素抵抗。2.二甲双胍干预6周后各组小鼠一般指标的变化与CON组相比,HFD组小鼠体重显著增加。应用二甲双胍3周后,高脂组小鼠体重显著下降。6周后进行IPGTT,HFD组较CON组小鼠在0 min、30 min、60 min和120 min血糖水平显著升高,二甲双胍干预后上述时间点血糖水平明显下降,三组小鼠在15 min血糖水平无明显差异。与CON组相比,HFD组小鼠AUC显著增加,二甲双胍干预后AUC显著下降。HFD组比CON组小鼠空腹血糖、胰岛素水平明显升高,QUICKI值显著下降,二甲双胍可逆转此结果。3.各组小鼠血脂水平比较与CON组相比,小鼠给予高脂饮食8周后TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低;高脂组小鼠给予二甲双胍干预6周后,TC、TG水平呈下降趋势,HDL-C水平呈上升趋势,LDL-C变化趋势不明显。4.各组小鼠肝脏组织形态学比较H＆E染色示,CON组肝索结构清晰可见,肝细胞排列规则,脂滴空泡罕见;HFD组肝细胞肿胀,排列紊乱,胞浆内可见大量脂滴空泡;二甲双胍干预后肝细胞脂滴空泡明显减少。油红O染色示,CON组肝细胞未被红染,橘红色脂滴较少;HFD组肝细胞明显红染,可见大量橘红色脂滴;二甲双胍干预后橘红色脂滴明显减少。5.小鼠肝脏lncRNAs和mRNAs的表达谱与CON组相比,小鼠给予高脂饮食后肝脏组织可筛选出差异表达的lncRNAs中,上调基因1823个,下调基因1253个;差异表达的mRNAs中,上调基因892个,下调基因511个。与HFD组相比,二甲双胍干预后,小鼠肝脏组织可筛选出差异表达的lncRNAs中,上调基因702个,下调基因867个;差异表达的mRNAs中,上调基因216个,下调基因307个,散点图显示了组间差异表达的lncRNAs和mRNAs分布情况。6.小鼠肝脏中被二甲双胍逆转的lncRNAs和mRNAs的表达谱韦恩图显示,HFD组与CON组相比,在3076个差异表达的lncRNAs和1403个差异表达的mRNAs中,有588个lncRNAs和209个mRNAs可被二甲双胍逆转。7.RT-qPCR验证5个lncRNAs在三组中存在显著的表达差异高通量测序分析显示,在高脂饮食诱导胰岛素抵抗的lncRNAs中,部分可被二甲双胍逆转。为了验证测序结果,根据lncRNAs的表达量情况选出了3个HFD上调和HFD+MET下调的lncRNAs（NONMMUT153838.1,NONMMUT031874.2和NONMMUT119418.1）以及2个HFD下调和HFD+MET上调的lncRNAs（NONMMUT051032.2,NONMMUT153848.1）并进行定量RT-q PCR检测。如RT-q PCR所示,证实5个lncRNAs的表达水平与测序分析结果一致。8.二甲双胍逆转的mRNAs的GO及KEGG分析对差异表达的mRNAs做GO富集分析,发现GO富集到的生物过程（biological process,BP）主要有:甘油三酯代谢过程,p38MAPK通路,趋化性的正向调节;分子功能（molecular function,MF）主要有:单加氧酶活性,趋化活性;细胞成分（cellular component,CC）主要有:蛋白质-脂质复合物,脂蛋白颗粒。KEGG分析提示,差异表达的mRNAs富集到了小细胞肺癌,MAPK信号通路,细胞衰老和胰岛素信号通路等。胰岛素信号通路和MAPK信号通路均与高脂饮食诱导的小鼠胰岛素抵抗模型相关,并且发现差异表达的mRNAs中Socs3与胰岛素信号通路密切相关。9.Socs3 mRNA及胰岛素信号通路相关基因PEPCK mRNA,PI3K mRNA,AKT mRNA的测定RT-qPCR结果显示,与CON组比较,HFD组小鼠肝脏组织Socs3、PEPCK mRNA表达水平显著增加,二甲双胍干预后上述指标明显下降,差异均有统计学意义,PI3K mRNA、AKT mRNA表达水平两组之间无明显异常。10.Socs3及胰岛素信号通路相关基因PEPCK、p-AKT、p-PI3K蛋白的测定Western blot结果显示,HFD组小鼠肝脏组织Socs3和PEPCK蛋白表达水平比CON组显著增加,p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K水平明显下降,而HFD+MET组比HFD组Socs3和PEPCK表达水平显著下降,p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K水平明显增加。此结果表明二甲双胍改善了高脂饮食喂养的小鼠胰岛素抵抗信号通路。小结:lncRNA可能在二甲双胍改善胰岛素抵抗中发挥重要作用。在高脂组被二甲双胍逆转的mRNAs主要富集在MAPK和胰岛素信号通路。差异基因Socs3与胰岛素信号通路密切相关,二甲双胍通过抑制Socs3表达作用于PI3K/AKT信号通路改善胰岛素抵抗。第二部分二甲双胍通过lncRNA NONMMUT031874.2抑制Socs3的细胞学水平验证目的:培养AML12细胞,PA干预建立胰岛素抵抗模型,进一步在细胞水平研究二甲双胍如何通过调节NONMMUT031874.2抑制Socs3表达改善肝脏胰岛素抵抗。方法:AML12小鼠正常肝细胞系,PA干预建立胰岛素抵抗模型,根据高通量测序结果、lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络和差异mRNAs富集的pathway分析,筛选出lncRNA NONMMUT031874.2和Socs3与胰岛素信号通路密切相关。为了进一步研究NONMMUT031874.2作用机制,将3个不同序列的siRNAs转染至AML12细胞,转染后NONMMUT031874.2 mRNA水平的测定作为转染效率的评价,从中选取转染效率最佳的siRNA用于后续实验。将AML12细胞分为:对照组（CON）、PA干预组（PA）、PA+MET 1m M组（PA+MET）、PA+siRNA-NONMMUT031874.2阴性对照组（PA+siRNA-NC）、PA+siRNA-NONMMUT031874.2敲低组（PA+siRNA-NONMMUT031874.2）。转染24 h后,PA组和PA+MET组给予相应干预,24 h后每孔加入胰岛素储存液5.7μl,40 min后提取蛋白,Western blot用于检测关键蛋白的表达。结果:1.lncRNA（NONMMUT031874.2）-miRNA-mRNA共表达网络在筛选并验证的5个lncRNAs中,NONMMUT031874.2的表达量较高,且可通过mi R-7054-5p、mi R-7669-3p、mi R-1894-3p和mi R-7076-5p、mi R-7016-3p来调控mRNA Socs3。2.AML12细胞胰岛素抵抗模型建立AML12细胞给予PA干预后,分别于0 h、8 h、16 h和24 h测量培养基中葡萄糖浓度。结果显示,PA组培养基中的葡萄糖浓度在16 h和24h明显高于CON组,表明体外胰岛素抵抗模型成功建立。3.转染效率3个不同序列siRNAs转染AML12细胞24 h后,通过RT-q PCR结果显示与CON组比较,3个siRNAs组NONMMUT031874.2 mRNA表达水平均下降,与siRNA1组、siRNA2组相比,siRNA3组NONMMUT031874.2mRNA表达最低,且与siRNA2组有统计学差异,提示siRNA3敲低效率最显著,可作为最终干预siRNA。4.沉默NONMMUT031874.2后mi R-7054-5p mRNA表达siRNA转染AML12细胞后,与CON组比较,PA组和PA+siRNA-NC组mi R-7054-5p mRNA表达明显降低;与PA组比较,PA+siRNANONMMUT031874.2组和PA+MET组mi R-7054-5p mRNA表达明显升高,而PA+siRNA-NONMMUT031874.2和PA+MET组比较,mi R-7054-5p mRNA表达无明显变化。5.沉默NONMMUT031874.2后各组细胞培养基葡萄糖浓度变化siRNA转染AML12细胞后,PA组和PA+siRNA-NC组培养基葡萄糖浓度比CON组明显升高;而PA+siRNA-NONMMUT031874.2组和PA+MET组培养基葡萄糖浓度比PA组明显下降。6.沉默NONMMUT031874.2后Socs3及胰岛素信号通路关键基因蛋白的表达Western blot结果显示,PA和PA+siRNA-NC组Socs3、PEPCK表达水平明显高于CON组,而p-AKT/AKT及p-PI3K/PI3K表达水平明显低于CON组。与PA组相比,敲低NONMMUT031874.2后,Socs3、PEPCK表达明显下降,而p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表达明显增加。二甲双胍干预后,PEPCK、Socs3表达较PA组明显降低,p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K表达较PA组明显增加。与NONMMUT031874.2敲低组相比,PA+MET组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT表达升高,PEPCK表达降低,但无明显统计学差异,Socs3表达明显下降。PI3K和AKT在各组之间表达均无明显差异。以上结果表明,二甲双胍通过下调NONMMUT031874.2,抑制Socs3的表达改善胰岛素抵抗。小结:二甲双胍通过抑制Socs3表达,作用于PI3K/AKT信号通路改善PA诱导的AML12细胞胰岛素抵抗,沉默NONMMUT031874.2与二甲双胍作用类似。二甲双胍通过下调NONMMUT031874.2,抑制Socs3表达作用于PI3K/AKT信号通路来改善胰岛素抵抗。第三部分二甲双胍对2型糖尿病患者Socs3及炎症因子CRP、IL-6等表达的影响目的:本部分主要研究Socs3与胰岛素抵抗关系,二甲双胍对糖尿病患者糖脂代谢、胰岛素抵抗、Socs3及血清炎症因子的影响,从而为二甲双胍的临床作用提供新的靶点。方法:选取2019年12月～2021年3月在我院内分泌门诊就诊的初发2型糖尿病患者110例为2型糖尿病组（T2DM）,糖尿病诊断均符合《中国2型糖尿病防治指南》（2017版）诊断标准,7%≤Hb A1c≤10%,病程6-40个月,年龄18-65岁之间。排除标准:1)服用任何降糖药物及激素等影响血糖药物;2)糖尿病急性及严重慢性并发症,急慢性感染性疾病,严重的全身系统性疾病,6个月内发生重大创伤、手术、恶性肿瘤等;3)妊娠或哺乳期妇女;4)严重肝肾功能障碍、心脑血管疾病或患有精神性疾病者。同期选择年龄、性别与糖尿病组相匹配的在我院体检中心健康查体人群为正常对照组（NC）57例。初发2型糖尿病患者110例随机分为2型糖尿病单纯饮食控制+运动3个月55例,和在此基础上口服盐酸二甲双胍治疗3个月55例。收集受试者的一般资料,如年龄、性别、病程、吸烟史、饮酒史、家族史;均禁食水8 h后于次日清晨测量身高、体重、计算体重指数BMI,抽血化验空腹血糖（FBG）、糖化血红蛋白（Hb A1c）、血脂、空腹胰岛素,同时测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）、C反应蛋白（CRP）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）及RT-q PCR测细胞信号转导抑制因子3（Socs3）水平,并进行Socs3及炎症因子与胰岛素抵抗相关性分析及二元Logistic回归分析明确胰岛素抵抗的独立危险因素,二甲双胍治疗3个月后复测上述指标。结果:1.正常对照组和2型糖尿病一般指标、Socs3和炎症因子比较NC组和T2DM组之间年龄、性别无显著差异,T2DM组BMI、TC、TG、LDL-C、Hb A1c、FBG、HOMA-IR、Socs3及上述炎症因子水平比NC组明显升高,差异有统计学意义。2.Socs3及炎症因子与胰岛素抵抗指数相关性分析Spearman相关性分析表明,Socs3及炎症因子CRP、IL-6、TNF-α、MCP-1与胰岛素抵抗指数均呈正相关。3.二元Logistic回归分析胰岛素抵抗的影响因素二元Logistic回归分析结果表明,矫正性别、年龄等混杂因素后,Socs3、TNF-α、TG、LDL-C是胰岛素抵抗的独立危险因素。4.二甲双胍治疗前后一般指标、Socs3及各组炎症因子水平变化二甲双胍治疗前两组年龄、HbA1c、BMI、病程、TC、TG、Socs3及炎症因子CRP、IL-6等均无明显统计学差异,二甲双胍治疗3个月后,与T2DM组饮食控制+运动3个月比较,T2DM+MET组BMI、Hb A1c、TC、TG、Socs3、IL-6、TNF-α、MCP-1水平明显下降,差异有统计学意义,CRP水平无明显变化。小结:1.2型糖尿病患者血糖、血脂、HOMA-IR、Socs3及炎性因子IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1水平明显升高。2.Socs3及炎性因子IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1水平与胰岛素抵抗指数呈正相关,且二元Logistic回归分析提示矫正年龄、性别混杂因素,Socs3、TNF-α、TG、LDL-C仍是胰岛素抵抗的独立危险因素。3.二甲双胍治疗后血糖、血脂、Socs3及上述炎性因子水平下降,胰岛素抵抗改善。结论:1.二甲双胍的降糖机制部分是通过调节肝脏lncRNA和mRNA表达而实现,lncRNANONMMUT031874.2的表达可抑制肝脏Socs3的表达是二甲双胍改善肝脏胰岛素抵抗的新通路。2.二甲双胍治疗在改善血糖的同时,可降低Socs3及炎症因子IL-6、TNF-α、CRP、MCP-1的水平,且Socs3及炎症因子水平的变化与胰岛素抵抗改善密切相关。