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家禽糖脂代谢与哺乳动物不同,肝脏是家禽脂肪合成的主要器官。同时家禽血糖水平高于哺乳动物,骨骼肌胰岛素敏感性较低,其调控机制有待进一步研究。肉鸡生长发育速度快,为维持其能量代谢稳态,日粮中通常添加高水平油脂,以满足生长需要。哺乳动物上的研究表明表观遗传修饰与多种疾病的发生发展密切相关。m~6A修饰作为RNA修饰中最为常见的修饰,在机体糖脂代谢过程中发挥重要作用。本课题重点探究高脂日粮饲喂条件下肉鸡糖脂代谢调控机制,并以小鼠为模型,通过MeRIP-seq和RNA联合分析阐明了m~6A甲基转移酶METTL3（Methyltransferase-like 3,METTL3）对高脂日粮饲喂动物骨骼肌组织FOXO1（Forkhead box o 1,FOXO1）m~6A修饰水平以及相关通路蛋白表达的调控作用。并通过肠道菌群结构与骨骼肌m~6A甲基化修饰关联分析,确定参与该调控的肠道菌群。该结果为m~6A修饰在调控骨骼肌组织糖脂代谢中的作用提供了理论基础,且拓宽了对于肠道菌群与骨骼肌m~6A修饰之间关系的理解。主要内容如下:1.高脂日粮对肉仔鸡糖脂代谢和m~6A修饰的影响。肉仔鸡被随机分为2个组:Con组:饲喂正常日粮;HF组:饲喂高脂日粮（脂肪水平:1-21 d为3.99%;22-42d为4.92%）。结果表明:高脂组肉仔鸡肝脏组织和腿肌组织中TG（Triglyceride,TG）、TCHO（Total cholesterol,TCHO）的含量显著高于对照组（P＜0.05）。肝脏METTL3表达量显著升高,FTO（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）表达量显著降低（P＜0.05）,m~6A修饰水平显著升高（P＜0.05）。腿肌组织METTL3的表达量显著降低（P＜0.05）,m~6A修饰水平显著降低（P＜0.05）。脂肪组织m~6A甲基化相关基因表达无显著影响（P＞0.05）,对m~6A修饰水平无显著影响（P＞0.05）。以上结果提示,高脂日粮导致肉仔鸡糖脂代谢紊乱,肝脏和腿肌组织m~6A甲基化修饰水平改变,高脂日粮可通过改变METTL3的表达影响肝脏和骨骼肌组织m~6A修饰水平。2.高脂日粮对小鼠糖脂代谢和m~6A修饰的影响。选取体重相近的3周龄雄性C57BL品系小鼠40只,随机分为两组,每组20只,SPF（Specific pathogen Free,SPF）环境饲养,分别饲喂基础日粮（ND组）和高脂日粮（HFD组）。结果显示:高脂日粮饲喂小鼠4周后,HFD组小鼠体重、体脂率、空腹血糖水平显著高于ND组（P＜0.05）,血浆TCHO、HDL-CHO（High density lipoprotein cholesterol,HDL-CHO）、LDL-CHO（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-CHO）、GLU（Glucose,GLU）含量显著高于ND组（P＜0.05）。HFD组小鼠肝脏组织甲基转移酶METTL3和METTL14（Methyltransferase-like 14,METTL14）的表达量都显著升高（P＜0.05）,m~6A修饰水平显著升高（P＜0.05）。高脂组小鼠腿肌组织甲基转移酶METTL3表达量显著降低（P＜0.05）,m~6A修饰水平显著降低（P＜0.05）。研究表明高脂日粮导致小鼠糖脂代谢紊乱。高脂日粮通过改变METTL3和METTL14的表达,影响肝脏m~6A甲基化修饰水平。通过改变METTL3的表达,影响骨骼肌m~6A甲基化修饰水平。3.高脂饲喂小鼠肌肉组织m~6A甲基化的MeRIP-seq与RNA关联分析。取前述试验饲喂ND日粮和HFD日粮的小鼠腿肌组织。进行RNA-seq分析,研究发现,HFD组小鼠腿肌有547个基因表达水平发生了变化,其中438个基因表达上调,109个基因表达下调。KEGG通路分析和GO富集分析结果显示,HFD组相较于ND组小鼠腿肌转录水平发生变化的基因涉及肥厚心肌病、AMPK（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）信号通路、长链脂肪酸结合、胰岛素样生长因子结合、脂肪酸合酶活性等方面。而MeRIP-seq分析显示发生甲基化修饰motif为GGACU序列。m~6A甲基化发生区域主要为CDS区,占比47.6%。对差异甲基化基因进行富集分析,结果显示这些基因参与骨骼肌收缩、ATP（Adenosine triphosphate,ATP）代谢过程、糖原代谢过程、葡萄糖稳态,MAPK（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）级联反应等代谢进程,以及Fox O（Forkhead box o 1,Fox O）信号通路、PPAR（Peroxisome proliferators-activated receptors,PPAR）信号通路、PI3K-AKT信号通路、AMPK信号通路等调控途径。筛选差异基因,对其进行m~6A修饰可视化分析,FOXO1 m~6A修饰水平在高脂组变化程度较高,且富集到该基因参与PI3K-AKT信号通路结果提示高脂日粮可能通过METTL3/FOXO1/PI3K-AKT通路调控腿肌组织糖脂代谢。4.甜菜碱对高脂日粮饲喂小鼠糖脂代谢和m~6A甲基化的影响。选取体重相近的3周龄雄性C57BL品系小鼠40只,随机分为两组,每组20只,SPF环境饲养:分别饲喂基础日粮（ND组）;高脂日粮（HFD组）。高脂组小鼠肥胖模型构建成功后,将ND组和HFD组小鼠随机分为两个处理:正常饮水,或饮水中添加1%甜菜碱（BET）。结果表明高脂添加甜菜碱（HFBET）可缓解高脂日粮饲喂导致的肥胖和血糖升高,提高冷刺激状态下小鼠的产热能力（P＜0.05）。HFBET组小鼠腿肌METTL3蛋白表达量显著升高（P＜0.05）,m~6A修饰水平显著升高（P＜0.05）。FOXO1 m~6A修饰可视化分析显示HFBET组小鼠腿肌FOXO1 m~6A修饰水平与HFD组相比有显著差异（P＜0.05）。Pull down分析FOXO1结合蛋白,富集到这些蛋白参与氧化磷酸化、糖尿病性心肌病等相关代谢,相关结合蛋白主要为LPL（Lipoprteinlipase,LPL）、ATP2A3、ATP5D、ATP5K。结果提示高脂日粮添加甜菜碱组小鼠腿肌组织FOXO1 m~6A修饰水平受到调控,FOXO1 m~6A修饰可能参与m~6A修饰对高脂日粮饲喂小鼠腿肌组织糖脂代谢的调控。5.m~6A修饰对C2C12细胞糖脂代谢的调控机制研究。首先用胰岛素处理C2C12细胞,构建体外模型,构建METTL3的Sh RNA和过表达METTL3的慢病毒分别敲减和过表达METTL3,处理C2C12细胞。结果显示,胰岛素处理C2C12细胞显著降低METTL3蛋白水平（P＜0.05）,并激活PI3K-AKT信号通路（P＜0.05）。Sh METTL3处理C2C12细胞,显著降低METTL3蛋白水平（P＜0.05）,提高糖摄取能力（P＜0.05）,促进GLUT4（Glucose transporter 4,GLUT4）移位到细胞膜（P＜0.05）,激活PI3K-AKT信号通路。慢病毒过表达METTL3显著升高METTL3蛋白表达（P＜0.05）,m~6A修饰水平显著升高（P＜0.05）,升高FOXO1蛋白磷酸化水平（P＜0.05）,降低糖摄取（P＜0.05）。结果验证了m~6A修饰可能通过METTL3/FOXO1/PI3K-AKT通路调控成肌细胞糖脂代谢。6.肠道菌群与m~6A修饰的关联性分析。分别取饲喂高脂日粮肉鸡和小鼠盲肠食糜,通过16S r RNA测序分析肠道菌群。对肉仔鸡肠道菌群结构分析,结果表明,高脂日粮组肉仔鸡肠道特有OUT 525个,beta多样性分析显示高脂日粮与对照组样本群落组成结构有差异,主要表现在高脂日粮在门水平降低Bacteroidetes丰度,升高Verrucomicrobia丰度。在属水平,高脂日粮降低Alistipes、Lachnospiraceae、Clostridiales的丰度,升高Bacteroides、Akkermansia、Faecalibacterium、Intestinimonas的丰度。对小鼠肠道菌群的分析结果表明,高脂组小鼠特有的菌群有2532个,其中在门水平升高了Firmicutes、Proteobacteria的丰度,Bacteroidetes、Actinobacyeria的丰度降低;在属水平上,高脂日粮升高Lactobacillus、Desulfovibrionaceae、Lachnospiraceae的丰度,降低Muribaculaceae、Dubosiella、Bifidobacterium的丰度。HFBET组小鼠肠道Lactobacillus丰度降低,Lachnospiraceae、Ruminiclostridium、Dubosiella丰度升高。将ND组、HFD组、HFBET组小鼠肠道菌群属水平丰度与腿肌m~6A修饰水平进行关联分析,结果显示,Bifidobacterium的丰度与腿肌组织m~6A修饰水平呈显著负相关,Lachnospiraceae、Bacteroides、Clostridium的丰度与腿肌组织m~6A修饰水平呈显著正相关,其他菌属丰度与腿肌m~6A修饰水平无显著相关性。提示Bifidobacterium、Lachnospiraceae、Bacteroides、Clostridium可能参与m~6A修饰对高脂日粮饲喂小鼠腿肌组织糖脂代谢的调控。综上所述,高脂日粮导致肉鸡和小鼠糖脂代谢紊乱,m~6A甲基化修饰对高脂日粮饲喂肉鸡和小鼠的肝脏和骨骼肌调控机制不同。高脂日粮饲喂状态下,m~6A甲基化修饰可能通过METTL3/FOXO1/PI3K-AKT通路调控骨骼肌糖脂代谢。肠道Bifidobacterium、Lachnospiraceae、Bacteroides、Clostridium可能参与高脂日粮饲喂条件下m~6A修饰对骨骼肌糖脂代谢的调控。