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目的:自噬、溶酶体在抑制炎症小体活化的过程中具有重要意义。巨噬细胞的自噬直接或间接调控炎症小体的活化,但是在炎性刺激过程中,炎症与自噬的相互调节机制有待进一步发展;ATP6V0d2特异性高表达在巨噬细胞中且受LPS抑制,其机制和病理生理学意义尚不清楚。因此,本文探讨了炎性刺激在活化炎症小体的同时对自噬的调节,重点阐述ATP6V0d2在调节自噬和炎症性疾病中的功能与机制。方法:(1)生物信息学分析,筛选巨噬细胞在炎性刺激(LPS等)作用下,哪些溶酶体相关基因受到调控。(2)体外探究LPS对BMDM的作用。野生型小鼠BMDM用LPS刺激后RT-PCR和Western Blot分别检测Atp6v0d2 m RNA和ATP6V0d2蛋白表达水平。(3)ATP6V0d2在体内水平对小鼠的影响。构建Atp6v0d2敲除鼠,LPS诱导WT和Atp6v0d2-/-小鼠内毒素休克,ELISA检测血清中炎性细胞因子水平。(4)体外检测WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM炎症小体活化水平。分离WT和Atp6v0d2-/-小鼠骨髓并用MCSF诱导分化为巨噬细胞(BMDM),先用LPS预处理,再用ATP,Si O2,Alum,MSU等刺激诱导巨噬细胞炎症小体活化,Western-Blot检测细胞上清中成熟分泌型IL-1β,caspase-1的蛋白量,ELISA检测上清中IL-6,TNF-α,IL-1β细胞因子。(5)构建小鼠DSS模型。1)比较野生型和Atp6v0d2-/-敲除小鼠肠炎病理症状和疾病程度:体重减轻程度,结肠长度,结肠病理切片H&E染色;2)为了确证敲除Atp6v0d2后DSS模型的病理改变源自于巨噬细胞和炎症小体的改变,我们用Clodronate liposomes清除巨噬细胞或anti-IL-1β中和IL-1β构建DSS模型,比较野生型和Atp6v0d2-/-敲除小鼠肠炎病理症状和疾病程度;3)检测DSS模型中野生型和Atp6v0d2-/-敲除小鼠肠巨噬细胞线粒体ROS水平。(6)比较WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM中线粒体的损伤程度:用Mito-SOX染色线粒体ROS,流式检测PE荧光强度;Mito-tracker Green和Mito-tracker Deep Red双染后流式检测并分析线粒体膜电位;电镜观察线粒体具体形态变化;用Mito-TEMPO抑制线粒体ROS检测炎症小体活化。(7)检测ATP6V0d2对自噬的调节。在炎性刺激下,透射电镜比较WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM中自噬体的数目,同时用GFP-RFP-LC3慢病毒转染WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM,并用雷帕霉素抑制m TORC1信号诱导自噬和Bafmycin A1抑制溶酶体功能进而抑制自噬降解,观察GFP和RFP的荧光点,分析判断是否影响了自噬流的完整。用雷帕霉素处理WT和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM不同时间点诱导自噬,Western-Blot检测LC3和p-62的变化趋势。(8)研究ATP6V0d2是否通过影响自噬溶酶体降解过程来调节炎症小体的活化。在炎性刺激的同时,用雷帕霉素和3MA分别促进和抑制自噬,比较野生型和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM炎症小体活化水平。Western-Blot检测细胞上清中成熟分泌型IL-1β,caspase-1的蛋白量。(9)探讨ATP6V0d2是否影响溶酶体功能。Lysotracker和Lysosensor检测野生型和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM溶酶体p H是否改变,Western-Blot检测溶酶体水解酶Cathepsin B的活化是否受影响,DQ-OVA直接检测溶酶体酸性降解功能是否改变。(10)回答ATP6V0d2是否介导了自噬体溶酶体融合及机制。在炎性刺激后,免疫荧光观察野生型和Atp6v0d2-/-小鼠BMDM中LAMP1与LC3,STX17,TOM20共定位,判断是否影响自噬体与溶酶体融合过程。如果影响,由于SNARE复合物在自噬体溶酶体融合过程中具有关键作用,因此IP检测ATP6V0d2是否结合在SNARE复合物上,是否影响复合物的组装。(11)逆转录病毒过表达ATP6V0d2在野生鼠和敲除鼠BMDM中,检测过表达ATP6V0d2后的自噬水平,线粒体损伤和炎症小体的活化强度。结果:(1)生物信息学分析,当LPS处理BMDM时,溶酶体基因Atp6v0d2被抑制最明显,因此我们选用Atp6v0d2作为我们的兴趣基因,其表达的ATP6V0d2为兴趣蛋白。(2)LPS抑制BMDM ATP6V0d2的基因转录和蛋白翻译水平,并且成时间和浓度依赖性。(3)LPS诱导的休克模型中,敲除Atp6v0d2的小鼠较野生型小鼠血清中IL-1β量增高,而IL-6,TNF-α无明显统计学义意义。(4)Atp6v0d2-/-鼠BMDM较WT鼠BMDM炎症小体活化增强,上清中检测到更多的IL-1β和caspase-1蛋白量。(5)DSS肠炎模型中,Atp6v0d2-/-鼠较WT鼠肠炎病理症状更加严重,体重减轻更明显,结肠长度更短。清除了巨噬细胞后Atp6v0d2-/-鼠较WT鼠病理症状无明显差异;中和IL-1β后Atp6v0d2-/-鼠DSS模型病理症状明显减轻。Atp6v0d2-/-鼠肠组织巨噬细胞较野生型肠组织巨噬细胞线粒体ROS明显升高。(6)敲除了Atp6v0d2的BMDM较野生型BMDM线粒体ROS水平增高,膜电位损失增加,线粒体脊损失和肿胀更加严重。抑制了mito ROS显著下调了炎症小体的活化,且WT BMDM较Atp6v0d2-/-BMDM无明显差异。(7)炎性刺激处理后,Atp6v0d2-/-BMDM较WT BMDM电镜下能观察到更多的自噬体,并且雷帕霉素处理WT BMDM 6h后多成红色亮点,而Atp6v0d2-/-BMDM中多成黄色亮点。雷帕霉素处理WT BMDM和Atp6v0d2-/-BMDM不同时间点,WT BMDM中LC3和p-62有明显的降解趋势,而Atp6v0d2-/-BMDM中LC3和p-62降解不明显。(8)雷帕霉素处理WT BMDM后炎症小体活化显著降低,3MA处理WT BMDM后活化水平显著增加,而Atp6v0d2-/-BMDM相对WT BMDM活化水平受雷帕霉素和3MA调控不明显。(9)在敲除Atp6v0d2后溶酶体p H和降解功能没有明显差异。(10)炎性刺激后,Atp6v0d2-/-BMDM较WT BMDM的LAMP1与STX17,LC3,TOM20共定位比例显著减少。(11)IP实验中,ATP6V0d2能与SNARE复合物结合,当敲除Atp6v0d2后,SNARE复合物组装明显减少。(12)过表达ATP6V0d2后能够显著促进自噬降解、损伤线粒体的清除和抑制炎症小体活化。结论:ATP6V0d2尽管不影响溶酶体功能,但是可以通过介导自噬体与溶酶体的融合从而抑制BMDM炎症小体活化,促进损伤线粒体的降解。敲除了Atp6v0d2的小鼠在LPS诱导的内毒素模型和DSS肠炎模型中病理症状更加严重。当LPS刺激巨噬细胞时,通过下调ATP6V0d2从而抑制自噬溶酶体降解进而促进炎症的发展。