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世界卫生组织统计表明,乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤,平均每8位成年女性中就有一位罹患乳腺癌,乳腺癌的发病率和致死率在女性恶性肿瘤中始终居首位。2014年全球女性乳腺癌新发病例和死亡病例分别占女性恶性肿瘤患者的29%和15%。虽然近年来在乳腺癌的发病机理方面已有大量的研究报道,并且有些靶点也已开发靶向药物用于临床治疗,但是疗效并不乐观,转移和复发仍然是对乳腺癌患者的极大威胁。因此亟需进一步深入研究和完善乳腺癌发病的分子机制,为其诊治提供新策略、新思路。微小RNA (microRNA, miRNA, miR)是新发现的一类内源性表达的单链短序列小RNA,长度约19-25个核苷酸序列,不编码蛋白质,广泛存在于真核细胞中,在进化上具有保守性。研究发现microRNA与包括肿瘤在内的多种疾病的发生发展紧密相关。microRNA的发现为研究完善乳腺癌的发病机制提供了极大的补充,具有广阔的应用前景。本课题检测了miR-372在乳腺正常上皮细胞和乳腺癌细胞中的表达情况；成功建立稳定高表达miR-372的乳腺癌细胞株(MCF7-miR-372);通过裸鼠荷瘤实验明确了miR-372在乳腺癌细胞增殖中的作用；并利用生物信息学方法筛选了miR-372下游的可能靶基因,并进一步通过实验证实p62是miR-372的下游靶标基因之一。本课题的研究成果将加深我们对乳腺癌发病的分子机理的了解,为乳腺癌的早期诊断和治疗提供新的线索,同时将可能为相关的新药开发提供重要的分子靶点。1.目的研究miR-372在乳腺癌中的作用并探讨其相关机制。2.材料和方法2.1应用实时荧光定量PCR分析乳腺正常上皮来源的永生化细胞株MCF.10A和乳腺癌细胞株MCF-7, T47D, Bcap-37中miR-372的表达情况。2.2利用慢病毒载体pLVX-miRNA,构建miR-372过表达质粒(pLVX-miR-372),与包装质粒共转染HEK293T细胞,包装出高滴度的病毒颗粒并感染MCF-7细胞,用嘌呤霉素(puromycin)筛选获得稳定表达miR-372的细胞株(MCF-7-miR-372).2.3建立裸鼠皮下移植瘤模型。将BALB/c裸鼠随机分为两组(实验组和对照组,每组8只),将MCF-7-miR-372细胞和MCF-7-vector细胞的细胞悬液分别接种于两组裸鼠右腋皮下,从接种后第7天开始记录数据,每周两次测量瘤体大小(最大和最小直径),动态观察、测量并记算肿瘤体积大小及荷瘤鼠体重。在接种后第29天时用颈椎脱臼法处死裸鼠,剥离移植瘤组织,称量瘤体重量,绘制生长曲线。2.4利用TargetScan, miRanda二个预测软件和GO功能富集分析方法,综合分析相关因素,筛选出miR-372可能的下游靶点p62。利用蛋白免疫印迹(Western Blot实验)检测乳腺癌细胞中过表达miR-372前后p62蛋白水平的改变；利用双荧光素酶报告基因实验进一步验证miR-372对p62的靶向调控作用。3.结果3.1与乳腺正常上皮来源的永生化细胞株MCF-10A相比,miR-372在乳腺癌细胞株MCF-7、T47D、Bcap-37中的表达均显著下调。3.2成功包装了miR-372过表达慢病毒并筛选建立稳定高表达miR-372的乳腺癌细胞株MCF-7-miR-372.3.3体内动物实验表明MCF-7-miR-372组(实验组)的裸鼠体内肿瘤体积和肿瘤重量都显著小于MCF-7-vector组(对照组)(p<0.05),具有统计学差异,表明过表达miR-372能显著抑制乳腺癌细胞的体内增殖能力。3.4Western Blot实验发现MCF-7-miR-372细胞中的p62蛋白水平显著低于对照组细胞,提示miR-372可能负向调控p62的表达。双荧光素报告基因实验结果证实miR-372能通过与p623-UTR结合,从而抑制p62的翻译。以上两方面的结果表明,p62很可能是miR-372直接作用的下游靶基因。4.结论4.1miR-372在乳腺癌细胞中表达下降,提示miR-372在乳腺癌中可能起到肿瘤抑制因子的作用。4.2过表达miR-372能显著抑制乳腺癌细胞的成瘤能力,表明miR-372在乳腺癌中起肿瘤抑制因子的作用。4.3miR-372可能通过靶向抑制p62在乳腺癌细胞中的表达水平,从而参与调控乳腺癌细胞的增殖。