以耻垢分枝杆菌（Mycobacterium Smegmatis AS1.0562）为乳酸氧化酶（Lactate Oxidase，LOD）制备的菌种来源，对其产酶发酵条件、乳酸氧化酶提取工艺、酶学性质及其固定化催化DL-乳酸生产丙酮酸进行了系统的研究。主要研究内容和结果如下：培养基中添加甘油3.0％，蛋白胨0.4％，DL-乳酸1.0％，维生素B₁ 0.005％，KH₂PO₄·H₂O 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，硫酸亚铁胺0.01％有助于产酶；优化发酵条件为：250mL三角瓶中装液量50mL，起始pH7.2，培养温度37℃，静置培养4d，乳酸氧化酶平均酶活为65.4U／mL。采用均匀设计法优化了乳酸氧化酶提取工艺，超声波法的最佳工艺条件为：超声功率100W，超声时间8min，磷酸盐缓冲液pH 7.8；冻融法的最佳工艺条件为：冻融次数4次，解冻时间25min，解冻温度37℃，磷酸盐缓冲液pH7.4；在优化工艺条件下，超声波法提取效果要优于冻融法。耻垢分枝杆菌经增菌诱导培养、超声波破碎、高速冷冻离心后获得乳酸氧化酶粗酶液，经30％～70％饱和度的硫酸铵分级沉淀及透析脱盐初步纯化后，对其酶学特性进行了研究，该酶的最适反应温度为37℃，反应温度高于65℃时酶蛋白基本上完全变性失活，55℃保温60min酶活保存40％；最适反应pH为7.4，在pH6.5～8.0范围内酶蛋白稳定；低浓度的Na⁺和Mn²⁺、Co²⁺对该酶有激活作用，Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、Cd²⁺对该酶有抑制作用；表面活性剂十二烷基磺酸钠、吐温20、吐温60能增强酶蛋白的热稳定性；酶的动力学分析表明：以DL-乳酸为底物的Km=9.24×10^-3mol/L，Vmax=2.42μmol/（min.mg）。采用海藻酸钠包埋、戊二醛交联方法固定化乳酸氧化酶，优化了固定化酶的制备条件，测试了部分酶学性质。1mL酶液和1mL 4％的海藻酸钠溶液混合后，用注射器滴入到20mL 0.2mol/L的GaGl₂溶液中，25℃静置固化2h后，过滤洗涤，转移到0.2％戊二醛溶液中25℃交联2h，再经过滤、洗涤和干燥得到球状固定化酶。经固定化后的酶，热稳定性得到显著提高，游离酶在65℃保温1h酶蛋白完全变性失活，而固定化酶在65℃保温1h仍可保持86％的酶活力；其最适酶促反应温度由37℃升至55℃，最适反应pH=7.4保持不变；在不加保护剂的条件下，4℃放置50d后游离酶仅保持40％以上的酶活力，固定化酶能保持80％以上的酶活力。该固定化乳酸氧化酶生物催化DL-乳酸生产丙酮酸，3h后丙酮酸产率可达75％，连续循环使用5个批次固定化酶活力仍保持有85％。