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目的:肝癌是仅次于胃癌和食道癌的恶性肿瘤,其发病具有隐匿性、死亡率高的特点,其发生和发展是多基因参与、多步骤完成的复杂过程。miRNA(microRNA)是非编码小分子RNA,可通过调控癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生、发展和转归过程。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物,具有早期诊断、鉴别诊断及确立诊断的作用。近年来研究发现AFP是一种与肝癌细胞生长密切相关的内源性蛋白。本实验室的前期工作表明AFP静默导致的生长抑制作用并不主要由于发生了细胞凋亡,而是细胞周期发生G1/S期转变停滞的结果。此研究的目的是为了证实是否存在miRNA调控AFP基因的表达,进而参与了肝癌细胞生长的调控过程。方法:为了研究miRNA在肝癌发生、发展中的影响,我们以AFP作为靶基因通过生物信息学方法预测出了与其3’UTR(3’untranslated region)区互补的miR-1236为研究对象,并且对其在肝癌细胞内的作用进行了深入的研究。首先,我们构建了带有AFP的3’UTR miR-1236靶位点的荧光报告载体,在肝癌细胞系中检测miR-1236对含有AFP3’UTR的荧光报告载体表达水平的影响,来验证AFP是否为miR-1236的靶基因。此后,又通过Real-time PCR和Western blot方法检测了 miR-1236对AFP的mRNA和蛋白水平的影响。在接下来的细胞生长功能实验中,用MTT、平板克隆形成实验检测了过表达及封闭miR-1236后对细胞活性及增殖能力的影响。在确认miR-1236与肝癌细胞生长表型相关之后,构建的质粒pcDNA3/AFP通过对细胞表型的挽救实验,进一步验证AFP是否为miR-1236的靶基因结果:荧光报告载体实验表明miR-1236能够抑制带有AFP靶位点的报告基因的表达。Real-time PCR 和 Western blot 的结果表明 miR-1236 能够影响 AFP 的 mRNA和蛋白水平。细胞生长功能实验的结果表明,过表达miR-1236能抑制肝癌细胞活性和增殖能力,封闭掉miR1236能增强肝癌细胞活性和增殖能力。外源性的增加细胞内AFP的水平,可以有效的挽救由过表达miR-1236引起的细胞生长表型的变化。结论:miR-1236是抑制肝癌细胞生长的重要miRNA,其发挥调节作用是通过调节AFP表达来实现的。