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凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)是一种兼具乳酸菌和芽孢杆菌优势的益生菌,相比于其他菌群,其芽孢体对热、酸、碱、盐等不敏感,目前已成为饲料领域微生态制剂的优势菌种之一。然而,它在实际应用过程中常受到高温、低pH以及胆盐等多种环境胁迫,阻碍其发挥益生功能。因此,在前期从健康猪肠道内容物中分离纯化并鉴定出一株具有一定益生性的凝结芽孢杆菌WT-03的基础上,本研究利用常压室温等离子体诱变(Atmospheric and room temperature plasma,ARTP)结合适应性进化(Adaptive laboratory evolution,ALE)策略对其诱变,选育出耐酸、耐胆盐等抗逆性能明显改善的目的菌株;进而,从胞内pH变化、细胞结构及细胞膜多层面初步探究其抗逆性机制;最后,考察并优化其固态发酵豆粕的性能和发酵条件,对比发酵前后的豆粕营养品质,以期为提升豆粕发酵效率和产品品质等提供研究基础。主要研究内容有:(1)采用ARTP结合适应性进化选育了耐酸、耐胆盐的高抗逆性凝结芽孢杆菌。ARTP处理15 s后,凝结芽孢杆菌的致死率达到93.84%。利用含0.3%(w/v)胆盐的MRS筛选培养基对诱变15 s的菌体进行初筛,得到30株生长态势良好、菌落较大的突变株artp-BC1、artp-BC2……artp-BC30。进而,利用含有pH 4.0、pH 3.5和pH 3.0 MRS培养基的24孔板对初筛菌进行复筛,最终得到artp-BC5、artp-BC15、artp-BC28等3株突变株。突变株在pH 3.0条件下的存活率显著高于出发菌株,分别为18.2%、19.3%和18.8%。40 d的梯度酸适应性进化结果显示,artp-aleBC15在pH 2.5存活率最高,为19.8%;而出发菌WT-03仅为7.15%。体外模拟胃肠道实验表明,artp-aleBC15、artp-BC15和WT-03最终存活率分别为22.4%、15.2%和7.98%。因此,artp-aleBC15的耐酸、耐胆盐等抗逆性能明显改善,现已保存于中国工业微生物菌种保藏中心,编号为CGMCC 1.17145。(2)初步探究了凝结芽孢杆菌突变株的抗逆性机制,结果表明:外界酸胁迫导致胞内pH(pHi)降低,pH 6.2时,artp-aleBC15、artp-BC15和对照组WT-03的pHi均在7.10左右;而pH 2.5时,突变株artp-aleBC15、artp-BC15和出发菌株WT-03的pHi分别为4.90、4.45和4.23。扫描电镜结果表明,artp-aleBC15在pH 2.5环境能更好的保持细胞完整性。artp-aleBC15能够形成更高强度的生物膜,且疏水性增强,通透性较低;另外,酸胁迫导致细胞膜饱和脂肪酸(Saturated fatty acid,FA)增多、不饱和脂肪酸(Unsaturated fatty acid,UFA)减少、不饱和度增大。荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现,pH 2.5时,突变株artp-aleBC15中编码脂肪酸合成的基因plsX、acpP及fabD表达量显著上调,分别是出发菌的7.00倍、15.99倍和9.47倍。(3)以酸溶性蛋白含量为测定指标,优化了B.coagulans artp-aleBC15固态发酵豆粕的条件。单因素及正交实验结果表明,在优化的发酵条件:接种量4%,料水比1.0:1.2和发酵温度37℃,发酵72 h后,豆粕中酸溶性蛋白含量由2.29%提高到20.44%、粗蛋白含量由46.77%提高到49.13%,总酸度由2.28提高到8.46,氨基酸总量由53.0%提高到55.8%。SDS-PAGE电泳图谱显示,发酵后豆粕中的主要蛋白被降解至分子量20 kDa以下。