肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia,MP)是引起人类呼吸系统感染的重要病原之一。近年来研究分析,随着对非典型病原体感染认识的深入,MP不但引起呼吸系统炎症,且与许多人类的慢性疾病发病密切相关,且部分患者病情严重。由于其临床表现多样化,因而易被漏诊或误诊,已引起普遍关注。MP感染的致病机制研究在过去几年中取得了很大的进展,对呼吸道上皮细胞的粘附、激活宿主免疫系统以及直接侵入宿主细胞等被认为是主要致病原因。尽管对MP致病机制有如此之多的研究,但MP的确切发病机制仍不清楚。针对这一情况,我们期望通过蛋白组学这一高通量手段发现未能明确的新关系。目前,有关肺炎支原体蛋白质组学的研究为数甚少。在本研究中,我们运用经典的双向凝胶电泳(2-DE)和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术,分析比较在感染与非感染MP情况下,人肺腺癌细胞A549胞内蛋白质组的表达变化,以期发现与MP发病机制相关的蛋白。首先,我们以不同浓度的MP感染A549细胞。通过MTT实验,测定A549细胞感染后的相对存活率,发现当MP的浓度在10CFU/cell以下时,对细胞存活率的影响较小,因此我们选用了MP浓度为10CFU/cell作为进一步实验的处理条件。其次,我们分别选择2h、8h和24h作为MP感染早、中、晚时间点。同时,我们将添加等量的新鲜支原体培养液作为阴性对照。处理结束后,提取各组的胞内蛋白,并进行蛋白定量。将各组蛋白进行2-D电泳,结果扫描入计算机,并通过PDQuest软件进行分析比对,以密度值相差2倍以上为MP诱导差异表达蛋白点。切取部分干扰少、丰度适合、易取的差异点进行质谱分析鉴定,最后总共切取40个点,送LC-MS/MS分析,最终有34个蛋白质点得到鉴定。我们发现,这些蛋白的主要生物学功能涉及细胞生理过程的多个方面,包括细胞应激及DNA损伤修复相关、信号转导相关、转录相关、蛋白质翻译、修饰和运输相关、细胞代谢及增殖分化相关和细胞骨架相关蛋白等。这些蛋白在MP感染后细胞内发生的病理变化、损伤、修复和转归起着至关重要的作用,提示我们所识别的差异蛋白是与MP感染后细胞发生病理变化及转归密切相关的蛋白,很可能包含与MP发病机制密切相关的重要蛋白。从这34个差异蛋白中,我们选择了2个(Lamin A/C和Ruvbl2)进行了Western bolt验证。结果显示,这两个蛋白的相对表达变化与质谱结果完全一致,直接证明了质谱结果的可靠性。通过上述研究,我们得出以下结论:MP感染可引起A549细胞内蛋白表达的变化。运用蛋白质组学技术分析A549细胞在MP感染情况下的差异蛋白质组,是探求MP发病机制的高效、可行的研究策略。