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目的:分离并鉴定胃癌相关成纤维细胞(gastric cancer-associated fibroblasts,CAFs)、癌旁正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)及原代胃癌细胞(primary gastric carcinoma cells),比较CAFs与NFs的增殖差异以及对原代胃癌细胞克隆形成的影响,初步探讨CAFs与NFs转录组学的差异。方法:(1)选取临床胃癌患者手术切除的胃癌组织及癌旁正常组织(距癌周5cm以上、病理检测阴性),剪碎后胶原酶消化接种于预先包被的培养瓶中,常规传代培养。用免疫细胞化学染色检测细胞中平滑肌肌动蛋白α(α-smooth muscle actin,α-SMA)和纤维细胞活化蛋白(fibroblast activation protein,FAP)的表达鉴定CAFs与NFs,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中α-SMA基因mRNA的表达水平;用HE染色、软琼脂克隆形成实验及免疫细胞化学检测细胞中癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)和角蛋白18(cytokeratin 18,CK-18)的表达鉴定原代胃癌细胞。CCK8实验检测CAFs与NFs的增殖并绘制生长曲线;将原代胃癌细胞分别与CAFs和NFs混合培养,平板克隆形成实验及结晶紫染色检测原代胃癌细胞的克隆形成能力;幽门螺旋杆菌以感染复数1:100分别感染CAFs及原代胃癌细胞,倒置显微镜下观察细菌对细胞的黏附情况。(2)挑选3对临床表型相似、病理诊断为胃腺癌的病人的CAFs与NFs,配对进行转录组学研究,以CAFs/NFs比值差异两倍以上的基因为有意义的差异表达基因,将3个生物学重要组的差异基因两两交集之后并集,利用omicsbean在线软件进行生物信息学分析。结果:(1)成功从胃癌组织中分离出8株CAFs,5株NFs,3株原代胃癌细胞,且均能良好传代培养。免疫细胞化学染色显示α-SMA、FAP的表达在CAFs中成强阳性,在NFs中弱阳性或阴性,且两者均不表达CK-18;RT-qPCR结果显示CAFs中α-SMA基因的m RNA表达量显著高于NFs,差异有统计学意义(P<0.05),提示CAFs与NFs分离成功。生长曲线结果显示培养3天后CAFs的生长速度显著高于NFs,培养六天时差异达到最大(P<0.05)。(2)HE染色结果显示3株原代胃癌细胞呈现多形性、核大、畸形、核质比增大、核仁数增多,免疫细胞化学染色显示原代胃癌细胞中CEA、CK-18的表达均为强阳性,软琼脂克隆形成实验结果显示3株原代胃癌细胞均能在体外三维生长形成克隆球,提示分离的原代胃癌细胞具有恶性特征,鉴定成功。当CAFs与原代胃癌细胞共培养后,原代胃癌细胞的克隆数(70.4±8.6),显著高于NFs组(35.2±5.7)与空白对照组(33.1±6.6)(P<0.05),而NFs组与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。此外,幽门螺旋杆菌不仅能够黏附胃癌细胞,也能黏附CAFs。(3)转录组学结果显示,在3个生物学重复组的CAFs中共获得147个差异基因,其中76个基因上调,71个基因下调。通过聚类分析、GO富集与KEGG富集,共富集到1727个生物学过程、84个细胞组分、153个分子功能和10个通路具有统计学意义。结论:1.成功从临床胃癌组织中分离到原代的CAFs、NFs和胃癌细胞。2.证实CAFs在体外的生长速度快于NFs,促进胃癌细胞克隆性生长的能力更强。3.在CAFs中获得147个差异表达的基因,参与肿瘤相关的重要生物学过程和信号通路,可能在胃癌的发生发展中起重要作用。