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酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(Acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase,ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶,在体内胆固醇代谢平衡过程中起到关键的调控作用。细胞内ACAT活性与细胞膜微结构域功能、高胆固醇血症、动脉粥样硬化早期病变泡沫细胞形成等直接相关。因此,国际上普遍认为ACAT及其功能作用过程是重要的药靶系统。在实验室研究积累的基础上,我的博士论文工作主要探索人ACATl表达在RNA水平的调控与在细胞水平的功能。
实验室前期工作表明,人ACATl低活性56-kD和高活性50-kD异构体分别从其mRNA的GGC1274-1276和AUG1397-1399密码子起始产生,而此对应于cDNA K1的mRNA含有可选择性长5’-非翻译区序列(5’-UTR,It1-1396)。本工作主要是探索来源于人7号和1号两条染色体的该5-UTR序列对ACATl mRNA稳定性和蛋白表达的影响。首先,构建含有不同长度5-UTR序列的人ACATl基因及其N端产物编码序列与荧光素酶基因的表达质粒并转染AC29细胞,分别用Western blot和RT-qPCR检测相应的蛋白表达和mRNA量。结果显示,人ACATl mRNA的可选择性长5-UTR能非常显著降低ACAT150-kD异构体及其N端产物与荧光素酶蛋白的表达,同时非常显著降低其mRNA的量,且长5-UTR对mRNA稳定性的影响远大于对翻译效率的影响。接着,利用ActD处理转染的细胞,抑制转录活性的结果显示,人ACATl mRNA的可选择性长5-UTR明显促进其mRNA的降解。进而,制备体外转录的RNA分别进行细胞质转染和细胞核转染的实验结果显示,在细胞核内和细胞质中,含有长5-UTR的mRNA降解速率都比不含长5-UTR的快。这些结果说明,人ACATl mRNA的长5-UTR主要通过促进其mRNA decay而调控ACATl表达。进一步,通过含有长5-UTR中7号和1号染色体来源序列缺失突变的质粒转染细胞进行一系列实验,揭示了7号染色体来源序列促进其mRNA快速降解、1号染色体来源序列反而增强其mRNA的稳定性的decay机制。这部分研究工作,为人ACATl mRNA转录后的跨染色体剪接及其调控机制提供了新认识,也可为ACAT精细调节人细胞胆固醇代谢平衡研究提供重要的分子基础。
在包括上述ACAT1分子水平调控等研究基础上,利用无明显ACAT2表达的神经细胞,深入探索ACAT1活性引起其底物游离胆固醇变化的功能。首先,利用ACAT抑制剂CP-113818处理神经细胞SK-N-SH,Filipin染色和细胞质膜游离胆固醇测定的结果均显示,ACAT1活性抑制引起细胞质膜游离胆固醇量显著增高,具有时间和剂量依赖性。同时,用Western blot检测细胞质膜APPα-型加工产物sAPPα的结果显示,ACAT1活性抑制引起APPα-型加工减少,也具有时间和剂量依赖性。并且利用CDX depletion细胞质膜胆固醇的结果证实,ACAT1抑制引起细胞质膜游离胆固醇量提高而导至APPα-型加工减少。以上结果表明,ACAT1引导神经细胞质膜游离胆固醇量而影响APPα-型加工。深入利用LPPS和Lova抑制细胞胆固醇的吸收、外运与合成代谢的结果显示,在细胞胆固醇较低水平条件下,ACAT1活性抑制仍能提高细胞质膜游离胆固醇量;而且在此条件下利用LDL或Mev增加细胞胆固醇的吸收或合成,也均无明显影响ACAT1引导质膜胆固醇量的变化。这些表明,ACATl引导神经细胞质膜游离胆固醇量具有很强的特异性和发挥重要功能作用。进一步,通过利用化合物U18666A抑制胆固醇转运至细胞质膜的NPC依赖途径等深入实验,发现ACAT1活性引导细胞质膜胆固醇量,还通过非NPC依赖的胆固醇转运途径。深入通过ACAT1的RNAi和过表达及胚脑组织培养等实验,证实了人ACAT1表达调控可引导神经细胞质膜游离胆固醇量而发挥其在细胞水平的功能作用。这部分工作,建立了一种ACAT1表达的细胞水平功能研究新体系,可促进拓展ACAT引导细胞质膜游离胆固醇的动态变化等前沿性探索。
本论文的两部分工作中,发现人ACATl mRNA可选择性长5-UTR主要是decay mRNA而调控ACAT1表达,发现神经细胞ACAT1引导质膜游离胆固醇量而发挥其在细胞水平的功能作用。这些人ACAT1的表达调控与功能研究,为深入探索ACAT在胆固醇代谢平衡中的生理功能与病理变化机理、为相关疾病的临床与药物研究等提供了理论依据和重要基础。