人酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1的表达与功能调控研究

来源 :中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所 中国科学院上海生命科学研究院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhongyi02w
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶(Acyl-coenzyme A:cholesterolacyltransferase,ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶,在体内胆固醇代谢平衡过程中起到关键的调控作用。细胞内ACAT活性与细胞膜微结构域功能、高胆固醇血症、动脉粥样硬化早期病变泡沫细胞形成等直接相关。因此,国际上普遍认为ACAT及其功能作用过程是重要的药靶系统。在实验室研究积累的基础上,我的博士论文工作主要探索人ACATl表达在RNA水平的调控与在细胞水平的功能。   实验室前期工作表明,人ACATl低活性56-kD和高活性50-kD异构体分别从其mRNA的GGC1274-1276和AUG1397-1399密码子起始产生,而此对应于cDNA K1的mRNA含有可选择性长5’-非翻译区序列(5’-UTR,It1-1396)。本工作主要是探索来源于人7号和1号两条染色体的该5-UTR序列对ACATl mRNA稳定性和蛋白表达的影响。首先,构建含有不同长度5-UTR序列的人ACATl基因及其N端产物编码序列与荧光素酶基因的表达质粒并转染AC29细胞,分别用Western blot和RT-qPCR检测相应的蛋白表达和mRNA量。结果显示,人ACATl mRNA的可选择性长5-UTR能非常显著降低ACAT150-kD异构体及其N端产物与荧光素酶蛋白的表达,同时非常显著降低其mRNA的量,且长5-UTR对mRNA稳定性的影响远大于对翻译效率的影响。接着,利用ActD处理转染的细胞,抑制转录活性的结果显示,人ACATl mRNA的可选择性长5-UTR明显促进其mRNA的降解。进而,制备体外转录的RNA分别进行细胞质转染和细胞核转染的实验结果显示,在细胞核内和细胞质中,含有长5-UTR的mRNA降解速率都比不含长5-UTR的快。这些结果说明,人ACATl mRNA的长5-UTR主要通过促进其mRNA decay而调控ACATl表达。进一步,通过含有长5-UTR中7号和1号染色体来源序列缺失突变的质粒转染细胞进行一系列实验,揭示了7号染色体来源序列促进其mRNA快速降解、1号染色体来源序列反而增强其mRNA的稳定性的decay机制。这部分研究工作,为人ACATl mRNA转录后的跨染色体剪接及其调控机制提供了新认识,也可为ACAT精细调节人细胞胆固醇代谢平衡研究提供重要的分子基础。   在包括上述ACAT1分子水平调控等研究基础上,利用无明显ACAT2表达的神经细胞,深入探索ACAT1活性引起其底物游离胆固醇变化的功能。首先,利用ACAT抑制剂CP-113818处理神经细胞SK-N-SH,Filipin染色和细胞质膜游离胆固醇测定的结果均显示,ACAT1活性抑制引起细胞质膜游离胆固醇量显著增高,具有时间和剂量依赖性。同时,用Western blot检测细胞质膜APPα-型加工产物sAPPα的结果显示,ACAT1活性抑制引起APPα-型加工减少,也具有时间和剂量依赖性。并且利用CDX depletion细胞质膜胆固醇的结果证实,ACAT1抑制引起细胞质膜游离胆固醇量提高而导至APPα-型加工减少。以上结果表明,ACAT1引导神经细胞质膜游离胆固醇量而影响APPα-型加工。深入利用LPPS和Lova抑制细胞胆固醇的吸收、外运与合成代谢的结果显示,在细胞胆固醇较低水平条件下,ACAT1活性抑制仍能提高细胞质膜游离胆固醇量;而且在此条件下利用LDL或Mev增加细胞胆固醇的吸收或合成,也均无明显影响ACAT1引导质膜胆固醇量的变化。这些表明,ACATl引导神经细胞质膜游离胆固醇量具有很强的特异性和发挥重要功能作用。进一步,通过利用化合物U18666A抑制胆固醇转运至细胞质膜的NPC依赖途径等深入实验,发现ACAT1活性引导细胞质膜胆固醇量,还通过非NPC依赖的胆固醇转运途径。深入通过ACAT1的RNAi和过表达及胚脑组织培养等实验,证实了人ACAT1表达调控可引导神经细胞质膜游离胆固醇量而发挥其在细胞水平的功能作用。这部分工作,建立了一种ACAT1表达的细胞水平功能研究新体系,可促进拓展ACAT引导细胞质膜游离胆固醇的动态变化等前沿性探索。   本论文的两部分工作中,发现人ACATl mRNA可选择性长5-UTR主要是decay mRNA而调控ACAT1表达,发现神经细胞ACAT1引导质膜游离胆固醇量而发挥其在细胞水平的功能作用。这些人ACAT1的表达调控与功能研究,为深入探索ACAT在胆固醇代谢平衡中的生理功能与病理变化机理、为相关疾病的临床与药物研究等提供了理论依据和重要基础。
其他文献
多倍化现象广泛存在动植物中,尤其是在植物界,已经从形态学、生理学、生态学、基因组学和进化生物学等多个方面进行了深入研究,而在脊椎动物中的探索较少。多倍体银鲫多重生殖方
在过去,建筑节能是指减少和降低建筑中的能量流失.而后,人们对它有了一个新称呼,“提高建筑中的能源利用率”.换而言之,要让建筑在给人们带来高舒适度的同时,又能实现能源使
回旋行波管在国防安全、外层空间小目标跟踪、精确气象监测等领域具有重要的应用价值,是下一代高分辨率成像雷达首选的发射机功率源。高频互作用电路是回旋行波管的核心部件
半导体自旋电子学主要研究自旋极化的产生、输运、控制和探测,近年来受到了学术界和产业界的极大关注。稀磁半导体(Ga,Mn)As兼备常规半导体特性和铁磁性,有望用来实现下一代半导
C、N、P是生物地球化学循环中的重要元素,其可利用性和各元素之间的平衡关系将生态系统的物质循环有机统一为一个整体。化学计量生态学为研究这几种基本元素间的平衡提供了一
目标检测技术是计算机视觉领域的重要研究方向之一,该技术在国防建设与国民经济等领域中有广泛的应用,例如军事目标制导、交通控制、智能视频监控等,都具有十分重要的研究意义。
InAs/GaSb超晶格材料因具有特殊的错开型能带结构,使其在红外探测方面有着广泛的应用前景,是目前国际上该领域的研究热点。与传统的红外探测材料相比,InAs/GaSb超晶格材料同时具
时间是客观存在的一个基本维度,认知活动中非常重要的一个方面是对时间的感知,然而目前我们对时间感知过程中的神经生物学机制却知之甚少。在时间间隔相关的任务中,实验对象必须
免耕被认为是实现农业可持续发展的一个重要手段,在我国其研究与推广主要集中在长江下游及东南地区。在华北平原,免耕播种玉米虽已得到广大农民的认可,但对于免耕小麦而言,由于相
谷氨酸和丝氨酸是植物光呼吸中两个重要的转氨酶。光呼吸可能在调控光合作用、碳氮代谢以及植物抗逆性中发挥重要的作用。研究GGAT和SGAT的生理功能及其作用机理,可望为提高作