论文部分内容阅读
目的:肥胖已成为全球性健康问题。据报道,孕期及哺乳期母体香烟烟雾暴露可使成年子代肥胖易感性增加。脂肪组织在与肥胖相关疾病的发生中有重要作用。而目前的研究大多关注孕期或哺乳期烟草或尼古丁暴露对子代白色脂肪组织（white adipose tissue,WAT）的影响,较少研究孕期及哺乳期单纯尼古丁暴露对子代棕色脂肪组织（brown adipose tissue,BAT）的影响。本课题旨在建立孕期及哺乳期母体尼古丁暴露大鼠模型,观察尼古丁暴露对子代BAT形态和功能的影响及其具体发生机制。同时,在细胞水平探寻尼古丁对棕色脂肪细胞功能相关因子的影响,阐明尼古丁对棕色脂肪细胞影响的具体发生机制,以期从“棕色脂肪白色化”角度揭示发育早期母体尼古丁暴露致子代肥胖易感性增加机制。方法:尼古丁组母鼠于孕9天开始皮下注射尼古丁（2.0 mg/kg/d）,持续至子代断奶,正常对照组皮下注射等体积生理盐水。分别于出生后4周和26周处死子代,收集肩胛BAT用于检测相关指标。观察子代大鼠体重及棕色脂肪量。通过苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色及电镜观察子代BAT形态学改变;利用免疫组化观察BAT标志蛋白解偶联蛋白1（uncoupling protein 1,UCP1）及血管标志蛋白CD34的表达和分布;使用实时荧光定量PCR及Western blot检测不同时期子代BAT中产热、血管生成相关基因及通路基因表达改变。在细胞水平,于C3H10T1/2细胞诱导分化第0-8天给予不同剂量（50 n M～50μM）尼古丁,实时定量PCR检测棕色脂肪细胞产热、血管生成基因及其相关通路基因表达;Western blot检测产热相关通路蛋白表达改变。结果:1)雄性子代改变:（1）体重、棕色脂肪重:尼古丁组雄性子代体重从出生后4周开始显著高于对照组（P<0.05,P<0.01）,且此趋势一直维持至成年后。出生后4周尼古丁组棕色脂肪重、棕色脂肪重/体重的百分比无显著性差异;出生后26周,尼古丁组棕色脂肪重显著高于对照组（P<0.05）,但棕色脂肪重/体重的百分比无明显差别。（2）形态学指标:出生后4周,尼古丁组脂滴大小及数目较对照组无明显变化,线粒体嵴分布无差别;而出生后26周尼古丁组脂滴体积明显增大,线粒体数目减少,线粒体嵴断裂、结构扭曲不规则。出生后4周尼古丁组BAT中UCP1蛋白阳性面积无明显变化,出生后26周尼古丁组UCP1蛋白阳性面积较对照组显著降低（P<0.01）;出生后4周及26周尼古丁组血管标志蛋白CD34阳性面积无明显变化。（3）棕色脂肪产热基因表达:雄性子代出生后4周,尼古丁组BAT中产热基因UCP1、细胞色素C1（cytochrome C1,Cyc1）及肉碱棕榈酰转移酶II（carnitine palmityltransferase II,Cpt2）表达均有降低趋势（P=0.067,P=0.052,P=0.057）;出生后26周,尼古丁组BAT中产热基因细胞死亡诱导DFFA样效应因子A（cell-death-inducting DFFA-like effector A,Cidea）、UCP1、柠檬酸合成酶（citrate synthase,Cs）、Cyc1及Cpt2表达较对照组均显著降低（P<0.01,P<0.05）,而PR结构域家族的第16个成员（PR domain-containing16,Prdm16）基因表达有降低趋势（P=0.059）。（4）AMPK—SIRT1—PGC-1α通路基因及蛋白表达:出生后4周尼古丁组PGC-1α基因显著降低（P<0.05）,PGC-1α蛋白有降低趋势（P=0.086）;出生后26周,尼古丁组雄性子代BAT中SIRT1、PGC-1α及UCP1基因及蛋白表达均较对照组显著降低（P<0.05,P<0.01）,AMPKα蛋白磷酸化水平较对照组显著下降（P<0.05）,AMPKα基因及蛋白水平无明显变化。（5）棕色脂肪血管生成基因表达:出生后4周血管生成相关基因无明显变化;出生后26周尼古丁组血管生成相关基因基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases 2,Mmp2）表达较对照组显著降低（P<0.05）。2)雌性子代改变:（1）体重、棕色脂肪量:尼古丁组雌性子代体重从出生后第6周开始显著增加（P<0.01,P<0.05）,且此趋势一直维持至成年后。出生后4周尼古丁组子代棕色脂肪量、棕色脂肪量/体重均无明显差异;出生后26周尼古丁组雌性子代棕色脂肪重显著高于对照组（P<0.05）,尼古丁组棕色脂肪重/体重的百分比较对照组有增加趋势（P=0.060）。（2）形态学指标:出生后4周,尼古丁组较对照组脂滴大小及数目无明显变化,线粒体嵴分布无差别,均较整齐;出生后26周,雌性子代对照组表现为经典的棕色脂肪细胞,而尼古丁组脂滴体积明显增大,线粒体数目明显减少,线粒体嵴有凌乱分布趋势。出生后4周,尼古丁组UCP1蛋白阳性面积无明显变化。出生后26周尼古丁组UCP1蛋白阳性面积显著降低（P<0.05）。出生后4周及26周尼古丁组血管标志蛋白CD34阳性面积显著降低（P<0.01,P<0.05）。（3）棕色脂肪产热基因表达:出生后4周,产热相关基因表达无明显改变;出生后26周,尼古丁组产热基因Prdm16、Cidea及UCP1基因表达均较对照组显著降低（P<0.05）,而产热基因Cs基因表达均有降低趋势（P=0.072）。（4）AMPK—SIRT1—PGC-1α通路基因及蛋白表达:出生后4周尼古丁组AMPK—SIRT1—PGC-1α通路基因及蛋白无明显变化;出生后26周,尼古丁组BAT中SIRT1、PGC-1α及UCP1的基因及蛋白表达较对照组显著降低（P<0.01,P<0.05）,而AMPKα蛋白磷酸化水平较对照组显著下降（P<0.05）。（5）血管生成相关基因:出生后4周尼古丁组BAT中血管生成相关基因血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor 2,Vegfr2）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A,Vegfa）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,Hgf）及Npy基因表达较对照组均显著下降（P<0.05）,Mmp2、Resistin有降低趋势（P=0.078,P=0.070）;出生后26周尼古丁组血管生成相关基因Vegfa、Mmp2、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor,Pdgf）有降低趋势（P=0.057;P=0.068;P=0.054）。3)细胞实验:（1）细胞活性:0～50μM尼古丁不影响细胞活性。（2）产热基因:50μM尼古丁剂量组Cs、Cyc1、Cpt2及Prdm16表达较对照组显著降低（P<0.05,P<0.01）。（3）AMPK—SIRT1—PGC-1α通路基因及蛋白:50μM尼古丁剂量组SIRT1、PGC-1α及UCP1基因表达较对照组显著降低（P<0.05）,但AMPKα1的基因表达无明显变化;50μM尼古丁可显著降低AMPKα蛋白磷酸化水平、SIRT1、PGC-1α及UCP1的蛋白表达水平（P<0.01,P<0.05）。（4）血管生成基因:50μM尼古丁可显著降低Vegfa、Hgf及Mmp2基因表达（P<0.05）,促血管生成素2（angiopoietin 2,Ang2）基因表达有降低趋势（P=0.058）。结论:孕期及哺乳期母体尼古丁暴露可致子代棕色脂肪白色化,进一步引起肥胖易感性增加。其可能机制为:一方面,尼古丁可抑制子代BAT中AMPK—SIRT1—PGC-1α通路,导致BAT产热功能低下,引起子代棕色脂肪白色化;另一方面,尼古丁也可能通过降低子代BAT血管生成因子表达,抑制血管生成,引起子代棕色脂肪白色化。最终,增加子代成年肥胖易感性。