春兰种质资源的SRAP分子评价及组织培养

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春兰(Cymbidium goeringii)属于兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)多年生草本植物,具有很高的观赏价值和经济价值。春兰若利用传统的分株繁殖,周期较长,成活率低,许多春兰传统名品无法大量繁殖,不利于种质资源的保存和利用。因此利用杂交育种与组织培养技术结合是国兰新品种选育的有效方法。而关于春兰种质资源遗传多样性方面,本研究从分子水平上揭示了部分春兰品种亲缘关系的远近,为春兰各品种间的分类和杂交亲本的选择提供重要理论依据。本研究从春兰的种质资源遗传多样性和组织培养等领域展开相应工作,以期对春兰种质的保护与开发和春兰名品的鉴定与保存提供理论基础和技术指导。取得的主要研究结果如下:1建立并优化了春兰SRAP-PCR反应体系,为获得春兰的SRAP标记图谱,对春兰SRAP-PCR反应体系进行了初步研究,通过正交试验设计,从Mg2+、dNTPs、Taq酶、引物、模板5种因素4个水平对春兰SRAP-PCR反应体系进行优化。SRAP-PCR最佳反应体系为:25μl反应体系中,Mg2+的浓度为2.5mmol/L,dNTP的浓度0.15mmol/L,Taq酶的量为0.5U,引物的浓度为1.2μmol/L,模板的质量为90ng。2从170对引物组合中筛选出条带清晰稳定、多态性好的引物15对。对47份兰花种质材料进行PCR扩增的结果表明:筛选出的不同引物组合扩增出的DNA片段长度在250-5000bp。15对引物组合在47份材料中共检测到185个位点,其中多态性位点184个,多态性比率(PPL)达99.46%,平均每对引物组合产生12.27个多态性位点.其中引物组合Me6-Em4多态性比率最低为90%;Me8-Em16的Nei’s基因多样性数H(0.3993)和shannon信息指数I值(0.5794)和有效等位基因数Ne(1.7280)都是最高值。3根据筛选出的15对多态性引物扩增结果进行聚类分析,采用UPGMA的分析法得到春兰种质的亲缘关系树状分析图,结果显示47份兰花种质遗传相似系数0.63-0.80。其中以来自于浙江绍兴的‘天彭牡丹’和‘锦绣中华’、‘金汪字’和‘新梅’以及来自于四川成都的‘绿梅’和‘黄梅’的遗传相似系数(0.80)最大。在遗传相似系数0.662处,将47份材料划分成五大类群,第Ⅰ类群又在遗传相似系数0.670处,划分为两大亚类群;第Ⅱ类群都属于春兰老八种,分别是瓣型为水仙瓣的3号‘汪字’和梅瓣的7号‘万字’;第III类群为瓣型为荷瓣的5号‘环球荷鼎’;第IV类群为瓣型为多瓣的18号‘四喜蝶’;第Ⅴ类群又在遗传相似系数为0.691处,划分为两大亚类群,其中45号春剑品种‘隆昌素’和47号蕙兰品种为一类,40号多花兰品种和46号多花兰与蕙兰杂交品种为一类。4不同培养基对春兰杂交兰‘金荷鼎’ב赤蕙’的根状茎生长情况有明显影响。春兰杂交兰‘金荷鼎’ב赤蕙’根状茎培养的基本培养基为1/2MS培养基;春兰‘金荷鼎’ב赤蕙’根状茎培养的最佳增殖培养基:1/2MS+NAA1mg/L+BA0.5mg/L+7g/L琼脂+20g/L蔗糖+3g/LAC;春兰‘金荷鼎’ב赤蕙’根状茎的最佳分化培养基:1/2MS+IBA0.2mg/L+BA2mg/L+7g/L琼脂+30g/L蔗糖。春兰杂交兰‘金荷鼎’ב赤蕙’最佳生根培养基:1/2MS+BA0.1mg/L+NAA2mg/L+7g/L琼脂+20g/L蔗糖+2g/LAC,此时组培苗长出的不定根数量和根长效果均最佳。5选择出了相对最适合春兰杂交兰组培苗的基质为仙土:麦饭石:松针:草炭=15%:45%:20%:20%(体积比),此时移栽的组培苗的成活率最高,新长出的水晶根的效果最好,病虫害最少。
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