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实验目的:通过观察p38MAPK信号通路抑制剂(SB203580)对人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)表达RANKL、OPG的影响,探究p38MAPK信号通路是否参与IL-17、HPDLF介导破骨细胞分化的过程。明确IL-17诱导人牙周膜细胞促骨吸收作用的可能信号转导途径,探讨IL-17参与正畸相关炎性牙根吸收的发生机制。实验方法:1.采用组织块培养法,体外培养原代HPDLF,并进行传代纯化。取第4代细胞,采用免疫荧光细胞化学法,对所培养的细胞进行来源鉴定。MTT法分别检测0、2.5、5、10、20、40μmol/L的p38MAPK抑制剂对HPDLF增殖活性的影响。2.Western blot检测20ng/ml的IL-17刺激HPDLF(0、20、40、60、80min)后,细胞内p38MAPK磷酸化蛋白的表达情况。3.实验分为六组:A组(空白对照)、B组(DMSO)、C组(抑制剂)、D组(IL-17)、E组(IL-17+DMSO)、F组(IL-17+抑制剂)。按照分组,用10μmol/L的SB203580,20ng/ml的IL-17处理细胞。RT-PCR检测HPDLF中RANKL、OPG因子的mRNA表达水平;Western blot、ELISA检测HPDLF中RANKL、OPG因子的蛋白表达水平。实验结果:1.培养的细胞为长梭形,呈放射状生长;传代后细胞均匀分布,生长状态稳定。经鉴定该细胞为来源于间充质细胞,且非上皮来源的细胞。结合取材部位可判定细胞为HPDLF。MTT结果显示,以浓度为0-40μmol/L的SB203580分别刺激HPDLF,0-10μmol/L中,OD值随着浓度的增加持续升高,HPDLF增殖活性逐渐增强。在10μmol/L中,OD值最大,HPDLF增殖活性达到最强。10-40μmol/L中,OD值随着浓度的增加逐渐下降,HPDLF增殖活性逐渐降低。2.在20ng/ml的IL-17刺激下,磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的相对表达量随着时间的增加而增大。在60min时达最高水平,80min时开始下降。3.与空白对照组比较,IL-17刺激后RANKL的mRNA、蛋白表达量升高;OPG的mRNA表达量降低;RANKL/OPG的mRNA比值升高。加入抑制剂后,IL-17刺激RANKL的mRNA、蛋白表达量降低;OPG的m RNA表达量升高,RANKL/OPG的mRNA比值降低。IL-17调控RANKL、OPGmRNA表达的作用,被p38MAPK抑制剂阻断。实验结论:1.组织块培养法成功地建立了人牙周膜成纤维细胞系。经传代,细胞纯化,细胞生物学性状稳定。适宜浓度的SB203580对HPDLF增殖活性有促进作用,但过大浓度的SB203580抑制HPDLF增殖,其中10μmol/L为HPDLF的最适浓度。2.IL-17能激活p38MAPK蛋白,且存在时间依赖性。IL-17通过p38MAPK通路促进HPDLF中RANKL的表达,抑制OPGmRNA表达;上调RANKL/OPG的mRNA比值。