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马立克氏病(Marek’s disease, MD)是由马立克氏病毒(Marek’s disease virus, MDV)引起的对鸡具有免疫抑制性的恶性T淋巴细胞肿瘤病,给养鸡业带来巨大的经济损失。广西三黄鸡是一种具有优良生产性能和经济价值的地方品种。近年来本实验室对广西区三黄鸡MD流行病学的调查研究显示,免疫过CVI988/Rispens或814的鸡群MD也时有发病。因此除了对鸡群采取有效的免疫防控和生物安全措之外,应该通过抗病育种的手段从遗传本质上提高三黄鸡的抗MD能力。之前本课题组已发现鸡的BF基因可变剪切外显子7与其MD抗性相关。课题首先采用实验室建立的半巢式PCR快速检测鸡BF基因可变剪切外显子7的技术对父母代公鸡的BF基因外显子7进行筛选,然后通过常规繁育方法分别获得三组子代,即K组(父母代公鸡BF基因有外显子7)、Y组(父母代公鸡BF基因无外显子7)和对照的P组(父母代公鸡未经BF基因外显子7筛选)。4日龄时,每组各取100羽鸡以MDV-1强毒株120015按500PFU/羽(0.2mL)腹腔注射进行攻毒。试验鸡按常规方法饲养,每天统计死亡情况,试验于攻毒后第10周结束,剖杀所有鸡只。所有试验期间死亡的个体以及试验结束剖杀的鸡只均解剖观察肿瘤病变并采集病变组织进行MDV的PCR检测。结果K组、Y组和P组的肿瘤发生率和死亡率分别为32.97%和52.75%、53.85%和71.43%、42.39%和63.04%,各组之间差异显著(p<0.05)；K组、Y组和P组试验鸡的BF基因外显子7检测阳性率分别为42.86%(39/91),19.57%(18/92)和30.77%(28/91),并结合肿瘤发生率进行卡方检验得出卡方值X和P值分别为9.548a、-0.002,6.907a、-0.009以及4.866a、0.027,表明三组试验鸡攻毒后肿瘤的发生与否都与BF基因外显子7的有无成显著相关(p<0.05)；所有试验鸡中,具有BF基因外显子7和无外显子7的个体的肿瘤发生率分别为22.35%(19/85)和52.38%(99/189),差异显著(p<0.05)。实验之二,对BF基因有外显子7的20个样本和BF基因无外显子7的10个样本分别进行克隆和测序,所得序列与已报道的MD抗性单倍体B21、B12、B5、B2及MD易感单倍体B19、B15、B13进行比对和遗传进化分析,结果显示20条BF基因有外显子7的序列中有10个与抗性单倍型相同,10条BF基因无外显子7的序列中有4个与易感单倍型相同,且它们分别在2个特征性位点上完全符合,即抗性单倍型的3S和87R、易感单倍型则为3P和87S;实验之三,课题制备和构建了BF基因可变剪切外显子7和内参基因β-acting的标准品质粒与实时定量PCR标准曲线,利用建立的实时定量PCR技术检测试验鸡在MDV攻毒后不同时相BF基因可变剪切外显子7(胞质尾区含外显子7或不含外显子7)的mRNA表达水平。经数据统计分析发现,BF基因有外显子7和无外显子7mRNA的表达水平在攻毒后的第4d差异不显著(p=0.6377>0.05),第7d差异显著(p=0.0443<0.05),第14d、21d和28d差异极显著(p<0.01)。此外,BF基因有外显子7mRNA的表达水平在MDV攻毒后的第7-28d一直维持着较高的水平,而BF基因无外显子7mRNA的表达水平则有较大幅度的下降。实验之四,建立了快速检测BF基因可变剪切外显子7的PCR方法,并采用此方法检测300份鸡BF基因样品,经测序鉴定与旧半巢式PCR技术检测结果不相符的样品,证实新方法准确性更高,检测时间也大为缩短,可在抗性育种的实际操作中应用。本课题通过动物攻毒试验,证买厂西三黄鸡的BF基因外显于7的序列特征与先前报道的血型抗性单倍型的相符且与抗MD肿瘤显著相关；通过选择BF基因有外显子7公鸡进行育种的简易、快速方法,可以获得具有明显MD抗性的后代；BF基因有外显子7和无外显子7的mRNA表达水平在MD攻毒后存在显著差异,进一步确定它是鸡MD抗性的相关基因。