呼吸化学感受器反射是一种重要的呼吸稳态调节机制,是机体与外界环境进行气体交换的主要方式,是维持正常新陈代谢和酸碱平衡的重要保证。呼吸化学感受性反射的反射弧由感受器、传入神经、呼吸中枢、传出神经和效应器组成。呼吸化学感受器又分为外周化学感受器和中枢化学感受器。外周化学感受器主要位于颈动脉体和主动脉体,又以颈动脉体为主,监测动脉血中PaCO2、PaO2和[H+]的增加;其传入神经为窦神经。中枢化学感受器主要位于低位脑干,包括孤束核(NTS),斜方体后核(RTN),迷走神经背核,延髓腹外侧头端区,中缝核和蓝斑核等,与呼吸中枢之间通过突触联系在一起。呼吸的节律中枢主要位于延髓腹侧,最终通过传出神经支配到效应器——呼吸肌上。当机体吸入过多CO2时主要兴奋中枢化学感受器反射,反射性的使呼吸加深加快,排除过多的CO2,维持机体酸碱平衡。当机体缺氧时,主要兴奋外周化学感受器反射,反射性的使呼吸加深加快,以达到吸入更多O2,维持机体正常供氧的作用。一旦呼吸化学感受性反射的感受器和/或呼吸中枢等部位发生结构或功能性改变,呼吸化学感受器反射不能正常进行,产生呼吸障碍疾病,如低通气综合征等。影响呼吸化学感受器反射的因素有很多,肥胖就是其中重要原因之一。肥胖造成的呼吸负荷过重和中枢驱动力的下降都是产生肥胖低通气的主要因素。近年研究发现由脂肪因子分泌的、在调节脂代谢平衡的关键因子——瘦素(Leptin),可能也参与了呼吸的调控作用,但其机制和作用靶点尚不明确。已有文献证实颈动脉体球细胞上主要分布有多种Leptin受体,其中起主要作用的是Leptin受体b亚型,即ob-Rb。同样在中枢化学感受器多部位上也发现有Leptin受体的广泛分布。已有研究发现Leptin缺乏的ob/ob小鼠高碳酸性通气反应(Hypercapnic Ventilatory Response,HCVR)减弱,而外源性补充Leptin可逆转此现象。但迄今为止,Leptin参与呼吸调控是否是通过其受体激活下游分子通路来实现的还未见报道,且其作用部位和作用机制仍需进一步研究。综上所述,本研究旨在进一步观察leptin系统是否参与呼吸化学感受器反射的调节,并验证此作用是否通过其受体及其下游通路来实现的,试图明确其作用环节、位点和机制。本研究以临床肥胖低通气综合症(obesityhypoventinationsyndrome,ohs)作为呼吸障碍模型,利用ob-rb受体缺陷zucker肥胖大鼠作为leptin信号通路缺陷组,借助无创体积描记系统(小动物肺功能测定)、分子生物学、免疫组织化学等技术,深入探讨以下几点内容:(1)明确leptin是否能易化中枢和外周呼吸化学感受性反射;(2)上述作用是否为受体依赖的,是否通过其下游信号通路来实现;(3)探讨leptin易化中枢呼吸化学感受性反射的作用靶点及其可能的机制;(4)明确leptin易化外周呼吸化学感受性反射的作用环节靶点和其可能的机制。第一部分:leptin易化中枢呼吸化学感受性反射的作用目的:通过激活和抑制leptin信号通路两种手段,证实leptin对中枢呼吸化学感受器反射的易化作用。方法:第一部分实验利用ob-rb缺陷大鼠,观察抑制leptin信号通路对中枢呼吸化学感受器反射的影响。实验动物分为四组:对照瘦zucker大鼠组(lean)和三组不同的肥胖低通气模型组,即单纯性肥胖低通气模型组(lean-hfd);ob-rb缺陷大鼠组(obese)和ob-rb缺陷大鼠合并过度肥胖组(obese-hfd)。测定大鼠血浆leptin水平和孤束核ob-rb下游通路中pstat3/stat3蛋白表达,验证各组动物leptin信号通路的功能状态;利用wbp清醒呼吸记录系统,描记清醒大鼠呼吸功能,阶梯性的给各组动物吸入含有2%,5%和8%co2的混合气体,记录每分通气量(mv)、潮气量(tv)和呼吸频率(bf)等呼吸参数的变化,以确定抑制leptin信号通路对hcvr敏感性的影响。第二部分实验通过皮下注射leptin,观察激活leptin信号通路对hcvr敏感性的影响。实验动物分为四组:对照注射盐水组(lean+saline)、对照注射leptin组(lean+leptin)、ob-rb缺陷注射盐水组(obese+saline)和ob-rb缺陷注射leptin组(obese+leptin)。lean+leptin和obese+leptin组大鼠连续皮下注射leptin(60μg/kg)7天,停药恢复21天,共计观察28天。lean+saline和obese+saline组注射相同剂量的生理盐水,作为空白对照。测定血浆leptin水平和孤束核leptin受体下游通路pstat3/stat3蛋白表达,以确定激活leptin信号通路的效果。利用wbp描记清醒呼吸功能,确定激活leptin信号通路对hcvr反应敏感性的影响。本部分使用的动物均预先去除双侧窦神经,已排除外周化学感受器的干扰。结果:1lean-hfd、obese和obese-hfd组大鼠体重均高于lean组(p<0.01),且伴有清醒时高碳酸血症(p<0.01)。obese和obese-hfd组大鼠血浆leptin水平均高于lean组,pstat3的蛋白表达均低于lean组(p<0.01)。而lean-hfd组大鼠的血浆leptin水平和pstat3的蛋白表达与lean组无差异。2基础状态下(100%o2),lean-hfd、obese和obese-hfd组大鼠的mv、tv均低于lean组,bf明显高于lean组(p<0.01)。结果表明,上述3组肥胖动物都存在低通气现象。3阶梯性吸入高浓度co2后,4组大鼠的mv均随co2浓度的增加而增加。其中lean-hfd组mv随co2浓度的增加,反应性逐渐趋向于lean组,在给予5%和8%co2时,和lean组已无差异。但obese组和obese-hfd组对co2的反应明显低于lean组(p<0.01),而obese组和obese-hfd组间无差异。4lean+leptin和obese+leptin组大鼠在注射leptin和消退过程中体重均逐渐增长,与注射saline组大鼠无明显差异。在注射leptin期间,lean+leptin和obese+leptin组大鼠血浆leptin水平均升高4-8μg/l(p<0.05~0.01),停药后逐渐消退。5在注射leptin的第7天,lean+leptin组大鼠孤束核pstat3/stat3表达明显升高(p<0.01),而obese+leptin组大鼠相对于obese+saline组无明显差异。6在注射leptin的第7天,lean+leptin和obese+leptin组大鼠动脉血paco2和ph值与lean+saline和obese+saline组大鼠无显著性差异。7在注射leptin的第7天,清醒常氧平静呼吸时,lean+leptin和obese+leptin组大鼠的mv、tv和bf值和lean+saline和obese+saline组相比无显著性差异。同样,各组大鼠注射前、注射第7天、消退各时间点的基础mv均无显著性差异,结合上述注射leptin后结果,说明注射leptin可以有效地激活leptin信号通路,但并不影响动物基础体重、血气和呼吸。8在注射leptin的第7天、消退的第1周、第2周,阶梯性升高co2各组大鼠吸入气体中的co2,lean+leptin组大鼠的mv变化幅度明显高于lean+saline组(p<0.01)。而obese+leptin组大鼠与obese+saline组的mv值无差异,说明注射leptin可以易化hcvr。小结:ob-rb缺陷可以降低动物对co2和/或高碳酸反应的敏感性;激活leptin信号通路可以增加对co2和/或高碳酸反应的敏感性,且能维持两周。此作用可能通过leptin受体信号通路及下游蛋白水平改变所实现。第二部分:孤束核参与leptin易化高碳酸性通气反应目的:通过激活和抑制leptin信号通路两种手段,探讨nts在leptin易化呼吸中的作用和可能机制。方法:第一部分观察ob-rb缺陷对nts酸敏感通道和受体的蛋白表达和co2敏感性神经元的数目的影响。实验动物分为3组:对照瘦zucker大鼠组(lean)、单纯性肥胖低通气模型组(lean-hfd)和ob-rb缺陷大鼠组(obese)。利用westernblot方法检测各组动物基础状态下nts组织中task通道、asic通道gpr4和kir2.3蛋白水平。用免疫荧光的方法统计各组动物经8%co2处理后,nts上co2敏感性神经元的数目。第二部分观察激活leptin信号通路对nts酸敏感通道和受体的蛋白表达和co2敏感性神经元的数目的影响。实验动物分为4组:lean+saline组、lean+leptin组、obese+saline组和obese+leptin组。利用westernblot方法检测各组动物nts上task通道、asic通道gpr4和kir2.3蛋白水平。用免疫荧光的方法统计各组动物经8%co2处理1小时后,nts的co2敏感性神经元的数目。结果:1基础状态下,ob-rb缺陷的obese组大鼠nts组织中的task-1,-2和-3通道蛋白,asic-1和-2通道,gpr4受体蛋白和kir2.3通道蛋白表达明显低于lean组和lean-hfd组(p<0.01),而lean和lean-hfd两组间无差异。2激活leptin信号通路后,lean+leptin组大鼠nts组织中task-1,-2和-3通道蛋白,asic-1和-2通道,gpr4受体蛋白和kir2.3通道蛋白表达明显高于lean+saline组(p<0.01),而obese+saline组与obese+leptin组大鼠nts组织中上述通道和受体蛋白水平无显著性差异。3经8%co2处理1h复氧1h后,obese组大鼠共表达ob-rb和c-fos的神经元总数目明显低于lean组和lean-hfd组(p<0.01),而lean组和lean-hfd两组间无差异。说明obese组大鼠co2敏感性神经元数目与lean组和lean-hfd组相比较少。4经8%co2处理1h复氧1h后,lean+leptin组大鼠共表达ob-rb和c-fos的神经元总数目明显高于lean+saline组(p<0.01),而obese+saline组与obese+leptin组大鼠组间无差异。说明激活leptin信号通路可以增加co2敏感性神经元数目。小结:leptin信号通路易化中枢化学感受器反射的作用可能通过leptin及其信号通路增加nts神经元敏感性和上调nts组织中task通道、asic通道、gpr4受体和kir2.3通道等酸敏感性通道表达所实现。第三部分:leptin易化外周呼吸化学感受性反射的作用和机制目的:通过激活和抑制leptin信号通路两种手段,探讨颈动脉体的leptin信号通路对外周呼吸化学感受器反射的易化作用及其可能的机制。方法:激活和抑制leptin信号通路的动物分组同第二部分。本部分比较各组动物双侧窦神经完整和切除双侧窦神经后,各组动物对低氧(10%o2)反应的差异,利用wbp记录清醒低氧性通气反应(hvr)的呼吸功能;westernblot法检测各组动物基础状态下颈动脉体氧敏感性通道task-1,-2,-3和kv1.5通道的蛋白表达,比较各组动物基础状态和低氧状态下颈动脉体c-fos蛋白的表达的变化。结果:1常氧状态下,ob-rb缺陷的obese组大鼠颈动脉体ob-rb受体蛋白和pstat3蛋白水平明显低于lean组和lean-hfd组(p<0.01)。2暴露于10%o2时,3组大鼠的mv都相对常氧时增加。而ob-rb缺陷大鼠在低氧时mv的变化值(△mv)明显低于对照组和饮食诱导的单纯肥胖大鼠(p<0.01)。切断双侧窦神经后,上述3组大鼠低氧时△mv均明显减少,且组间无显著性差异。3皮下注射leptin60μg/kg7天后,lean+leptin组大鼠颈动脉体的ob-rb受体蛋白和pstat3蛋白水平明显高于lean组(p<0.01),而obese+saline组与obese+leptin组大鼠颈动脉体的ob-rb受体蛋白和pstat3蛋白组间无显著性差异。4皮下注射leptin第7天,lean+leptin组大鼠在低氧(10%)时的mv、tv和bf与lean组相比明显增加(p<0.05~0.01)。而obese+leptin与obese+saline组大鼠的mv、tv和bf值无显著差异。5皮下注射leptin第7天,切除双侧窦神经的各组动物,对低氧(10%o2)的反应明显减弱,mv的变化都明显减少,且3组无显著差异。6皮下注射leptin第14天,lean+leptin组大鼠在低氧时的mv与仍明显高于lean组(p<0.01)。而obese+leptin组大鼠的mv值与obese+saline组相比无显著差异。7基础状态下,obese组大鼠颈动脉体的task-1、task-2、task-3和kv1.5的蛋白表达均低于lean和lean-hfd组(p<0.05~0.01),而lean和lean-hfd组间无显著性差异。8皮下注射leptin第7天,lean+leptin组大鼠颈动脉体的task-1、task-2、task-3和kv1.5的蛋白表达均高于lean(p<0.01)。而obese+saline与obese+leptin组间无明显差异。9在急性低氧处理前,lean、lean-hfd和obese组大鼠c-fos蛋白表达无差异,而在急性低氧处理后,虽3组动物颈动脉体的c-fos蛋白表达均有所升高,但obese组大鼠明显低于lean和lean-hfd组(p<0.01)。10皮下注射leptin第7天,在急性低氧处理前,4组大鼠c-fos蛋白表达无差异,而在急性低氧处理后,4组动物颈动脉体的c-fos蛋白表达均有所升高,其中lean+leptin组大鼠明显高于其他3组(p<0.01);而obese+saline与obese+leptin组间无明显差异。小结:ob-rb缺陷降低hvr的敏感性,而激活leptin信号通路可以增加hvr的敏感性,且能维持一周。leptin易化hvr的作用可能与其信号通路参与调节task-1,-2,-3andkv1.5等氧敏感性通道有关。第四部分:慢性间歇性低压低氧易化中枢呼吸化学感受性反射目的:观察慢性间歇性低压低氧对大鼠基础呼吸和高碳酸性通气反应敏感性的影响,并探讨其可能机制。方法:动物分为四组,对照组(control)、cihh处理组(cihh)、果糖诱导的肥胖组(hfd)和果糖诱导的肥胖大鼠经cihh处理组(CIHH-HFD)。利用WBP记录清醒低氧性通气反应(HCVR)的呼吸功能;用生物化学或分子生物学的方法检测血生化等指标。结果:1 HFD组大鼠在清醒常氧状态下,其每分通气量(MV),潮气量(TV),均明显低于对照组,而经低氧处理后,CIHH-HFD组大鼠的MV和TV与对照组无显著性差异。各组动物的呼吸频率(F)均无统计学差异。2当高氧高碳酸时,4组大鼠的MV随CO2浓度的增加而增加,但HFD组大鼠对CO2的反应明显低于对照组,而经CIHH处理后这一现象被改善。3四组大鼠的TV随CO2浓度的增加而增加,但HFD组大鼠的TV随CO2增加的幅度低于对照组(P<0.05~0.01,Fig.3B),而经CIHH处理后这一现象被改善。4四组大鼠的F随CO2浓度的增加而增加,而HFD组大鼠的呼吸频率在5%和8%CO2时明显高于对照组,而经CIHH处理后这一现象被改善。小结:CIHH可以改善果糖诱导的肥胖大鼠常氧状态下的低通气和对高碳酸性通气反应的敏感性,而这一作用可能是通过上调Leptin来实现的。结论:Leptin信号通路可易化中枢和外周呼吸化学感受器反射。其易化中枢化学性反射通过增加NTS神经元敏感性和上调NTS组织中Tasks通道,ASICs通道,GPR4和Kir2.3通道等酸敏感性通道表达所实现。其易化外周化学性反射通过上调颈动脉体的TASK-1,-2,-3 and Kv1.5等氧敏感性所实现的。