研究背景：食管癌(esophagealcancer, EC)也叫食道癌,是食管粘膜上皮及食管腺上皮的恶性肿瘤,主要有两种不同的临床病理类型：食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC),两种病理类型的肿瘤的发病机制和病理转归各不相同。在全球范围内,食管癌发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第9位和第8位。国际癌症研究中心(IARC)全球统计报告显示：2008年在世界范围内食管癌的新发病例为482,300例,因食管癌死亡的病例为406,800例。食管癌的分布呈现地域性分布特征,伊朗北部穿越中亚共和国到中国北方,这一区域被称为“食管癌地带”,其中90%的病理类型为鳞状细胞癌。2008年,中国大陆13.4亿人口食管癌新发25.9万例,发病率为16.7/10万,居全国各类恶性肿瘤第5位；死亡21.1万例,死亡率为13.4/10万,居第4位。按性别统计,我国男性食管癌患者17.6万,发病率为22.9/10万；死亡14.4万,死亡率18.7/10万；女性患者8.3万,发病率为10.5/10万,死亡6.7万,死亡率8.2/10万,男性发病率居各类恶性肿瘤第4位,女性居第7位,而死亡率男女均居第4位。我国食管癌的典型流行病学特征表现为明显的地区差异,局部地区的高发和其周边地区的相对低发形成鲜明的对比。食管癌在太行山脉附近的省份高发,河南省林州市食管癌发病率最高,病理类型多为鳞癌。在我国,食管癌已成为危害人民群众生命安全的公共卫生问题,尤其是在食管癌高发地区。然而,食管鳞癌的发病原因尚未完全清楚。流行病学研究发现,热烫饮食、营养缺乏、食用酸菜和亚硝酸盐污染的食物、霉菌毒素、吸烟饮酒等在食管鳞癌的发病中起重要作用。然而,只有部分暴露在这些环境的个体最终发生食管鳞癌；另外,在我国食管鳞癌的高发地区,食管鳞癌的发病呈现出家族聚集现象。这些现象说明除了环境因素外,遗传因素在食管鳞癌的发病中也同样起着重要作用。因此揭示食管鳞癌发病的内在遗传分子机制是一个迫切需要解决的问题。除了遗传学因素外,表观遗传学异常改变(尤其是DNA甲基化)在食管鳞癌的发病中同样扮演了重要角色,所以,揭示食管鳞癌的DNA甲基化特征并将其研究结果转化为临床应用显得非常必要。手术治疗是食管鳞癌的主要有效治疗手段之一,食管鳞癌早期没有特异性的临床表现,因此食管鳞癌在就诊时往往已是中晚期,相当部分病人已经失去了手术治疗机会,其5年生存率不到10%。但是,早期诊断的食管鳞癌手术治疗的5年生存率可达到95%。早期发现是决定食管鳞癌5年生存率的重要因素。研究发现,早期癌变即可引起甲基化异常改变,并且DNA甲基化变异可以在体液和早期病变活检组织中检测到,另外,DNA甲基化可以通过去甲基化药物干预逆转,提示基因的甲基化异常可能作为早期发现食管癌变和治疗干预的生物靶点。本课题应用高通量的Illumina methylation450K array技术,揭示了食管鳞癌的DNA甲基化组学特征,并且对食管鳞癌的DNA甲基化谱和表达谱联合分析,发现了168个潜在的功能性甲基化异常基因,进一步在分子层面认识食管鳞癌的发生、发展。另外,我们从发现的潜在的功能性甲基化基因中挑选2个基因进行了放大样本量的验证,并且评价了它们在血浆中的甲基化对食管鳞癌的诊断价值。本研究分为三个章节：第一章：目的：分析食管鳞癌的DNA甲基化组学特征。方法：利用Illumina methylation450K array技术,全基因组扫描食管鳞癌组织和对照正常食管粘膜组织的DNA甲基化。将芯片原始数据导入BRB-array Tool (4.3.2version)进行数据分析。结果：甲基化芯片原始数据聚类分析和多维尺度分析说明,食管鳞癌和正常组织存在差异。GO富集分析发现252基因集在食管鳞癌和正常组织之间存在差异,Biocarta Pathway和KEGG Pathway富集分析发现74个信号通路在食管鳞癌和正常组织之间存在差异。结论：食管鳞癌的DNA甲基化与正常食管粘膜组织存在差异,DNA异常甲基化可能在食管鳞癌的发生、发展中起着重要作用。第二章：目的：筛选出可能调控基因表达的DNA甲基化基因。方法：对食管鳞癌甲基化谱和表达谱联合分析,找出方向变化不一致的差异基因(比如,超甲基化的基因同时基因表达下调,去甲基化基因同时表达上调)。将基因导入DAVID在线分析工具(DAVID Bioinformatics Resources6.7)进行信号通路分析。结果：通过甲基化谱和表达谱的联合分析,发现168个基因的甲基化改变与表达变化方向相反。KEGG信号通路分析,发现这些基因参与了多个肿瘤相关信号通路。结论：食管鳞癌中DNA异常甲基化可能影响多个肿瘤相关信号通路基因,这些异常的DNA甲基化基因可能共同参与了食管鳞癌的发生、发展。进一步揭示了食管鳞癌是一个多基因异常的疾病。第三章：目的：检测EPPB41L3, GPX3在肿瘤组织及血浆中的甲基化频率差异,并且评价其对食管鳞癌的诊断价值。方法：收集食管鳞癌组织(n=42例)及癌旁组织(n=42例),食管鳞癌患者血浆(n=42例)和健康志愿者的血浆(n=50例)。应用甲基化特异性PCR (MSP)结合琼脂糖凝胶电泳检测EPB41L3, GPX3在组织和血浆中的甲基化状态。将实验结果录入SPSS20.0统计软件,计数资料两组间比较采用x2检验进行统计分析；用受试者工作特征曲线(ROC curve)分析血浆中EPB41L3与GPX3甲基化对食管鳞癌的诊断价值。结果：EPB41L3在肿瘤组织中的甲基化频率为59.5%,显著高于癌旁组织4.8%,差异有统计学意义(x2=28.873, P<0.001,n=84)。GPX3在肿瘤组织的甲基化频率为54.8%,癌旁组织为9.5%,差异有统计学意义(x2=19.704, P<0.001, n=84)。EPB41L3在肿瘤患者血浆中的甲基化频率为31.0%,GPX3在肿瘤患者血浆中的甲基化频率为40.5%,二者在健康志愿者的血浆中没有检测到甲基化。受试者工作特征曲线(ROC curve)分析发现,血浆中二者联合敏感性为57.1%,特异性100%,AUC=0.786(95%CI0.685-0.886)。结论：EPB41L3, GPX3在食管鳞癌组织和患者血浆中的甲基化频率高于癌旁组织和健康志愿者血浆的甲基化频率。联合检测能够提高敏感性同时不影响特异性。