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研究背景自发性蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）是一种急性出血性卒中,最常见的病因是动脉瘤破裂,其中超过1/3的幸存者留下永久性残疾、认知功能缺陷和抑郁、焦虑等精神症状,导致患者生活质量显著下降。目前研究显示,如果能及时干预SAH患者早期脑损伤（early brain injury,EBI）进程,可以有效改善患者的预后。EBI是指SAH发生72h内的病理生理过程。既往研究证实神经炎症与EBI密切相关,但具体机制尚不明确。铁死亡是一种依赖铁的脂质过氧化水平升高、与其他的细胞死亡形式不同的程序性细胞死亡方式,近期研究证实其与急性肺损伤、急性肾损伤和创伤性脑损伤等急性器官损伤疾病密切相关,还可能牵涉神经退行性疾病相关的病理过程,但其与EBI之间关系尚不明确。另有研究显示SAH后EBI释放损伤相关分子模式分子（damage-associated molecular-pattern molecules,DAMPs）促进炎症反应,会进一步造成脑损伤。而细胞在发生铁死亡后也会释放DAMPs,因此,我们推测铁死亡可能在SAH后一系列炎症反应中发挥着重要作用。本研究拟采用动脉穿刺法建立大鼠SAH模型,通过对模型大鼠神经功能、脑水肿、铁死亡和炎症相关信号通路的检测,深入探讨铁死亡在EBI中的作用及激活铁死亡的关键靶点因子,旨在寻找最大程度地降低EBI的风险和恢复神经功能的新方法。目的1.研究SAH大鼠模型的铁超载、铁死亡和DAMPs情况,明确SAH后铁死亡对神经元损伤及实验大鼠神经功能的影响。2.探讨抑制铁死亡能否减少血脑屏障破坏、减轻炎性反应,改善SAH后神经功能障碍。3.明确SAH后p53对铁死亡的调节作用,研究通过抑制p53能否减少铁死亡、改善SAH后神经功能障碍。方法第一部分1、通过颈内动脉穿刺法建立SAH模型,7-8周雄性SD大鼠被随机分为假手术组（Sham组）和蛛网膜下腔出血组（SAH组）,SAH组按造模后取材时间点不同再分为6h、24h、48h三个亚组;2、通过Western blot法检测铁死亡相关蛋白（p53、SLc7a11、GPx4）、脂质过氧化物（4-HNE）和DAMPs相关因子（HMGB1）在各组大鼠大脑皮质的表达水平;3、通过Perls-DAB染色和铁含量检测SAH造模后24h大脑皮质的铁沉积情况和铁含量;4、通过透射电镜观察SAH造模后24h大鼠大脑皮质中铁死亡的形态学特征。第二部分1、利用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）干预,将大鼠随机分为Sham组、SAH组、SAH+溶剂组（SAH+Vehicle 组）和 SAH+Fer-1 组,SAH+Vehicle 组和 SAH+Fer-1组在SAH术后30min腹腔注射DMSO或Fer-1;2、在SAH造模后24h对每组死亡率和采用改良的Garcia神经评分进行评估;3、大鼠在造模后24h处死,进行SAH分级和脑组织水含量的测定;4、取脑组织切片行Perls-DAB染色、4-HNE免疫组化,IgG免疫荧光检测血脑屏障破坏,FJB染色检测神经元死亡;5、取脑组织进行铁含量和GSH含量测定;6、Western blot法检测SAH造模后24h铁死亡相关蛋白（p53、SLc7a11、GPx4）、脂质过氧化物（4-HNE）、DAMPs相关因子（HMGB1）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、紧密连接相关蛋白（ZO-1）和基质金属蛋白酶家族蛋白（MMP9、MMP2）在大脑皮质的表达水平;7、利用透射电镜观察神经元细胞线粒体。第三部分1、利用p53抑制剂Pifithrin-alpha（Pft-α）干预,大鼠被随机分为Sham组、SAH组、SAH+Vehicle 组和 SAH+Pft-α组,SAH+Vehicle 组和 SAH+Pft-α 组在 SAH 造模后30min腹腔注射DMSO或Pft-α;2、在SAH造模后24h对每组死亡率和神经功能进行评估;3、大鼠在造模后24h处死,进行SAH分级和脑组织水含量的测定;4、取脑组织切片进行p53免疫荧光染色。5、取脑组织测定GSH含量。6、Western blot法检测SAH 造模后 24h 的 p53、SLc7a11、GPx4、4-HNE、HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达水平。7、利用透射电镜观察神经元线粒体。结果第一部分1、大鼠SAH后出现神经功能障碍。2、大鼠SAH后24h脑皮质脂质过氧化物明显增多,并且伴有铁死亡相关蛋白不同程度改变和HMGB1的释放。3、大鼠SAH后24h大脑皮质铁含量增多并伴有神经元线粒体萎缩。第二部分1、铁死亡抑制剂Fer-1可改善SAH后24h大鼠神经功能评分和脑水肿;2、Fer-1可减少SAH后24h大脑皮质IgG外渗,并抑制ZO-1水平下降和MMP9、MMP2的表达上调;3、Fer-1对SAH后大脑皮质中铁含量无影响。4、Fer-1可减少SAH后4-HNE水平和神经元线粒体萎缩。5、Fer-1可恢复SAH后24h大脑皮质SLc7a11、GPx4、GSH的水平,但对p53的表达无影响。6、Fer-1可抑制SAH后HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平升高。7、Fer-1可减少SAH后大脑皮质中神经元死亡。第三部分1、p53抑制剂Pft-α可改善SAH后24h大鼠神经功能评分和脑水肿。2、Pft-α可抑制SAH后p53在大脑皮质的表达。3、Pft-α可恢复SAH后24h大脑皮质中的SLc7a11、GPx4、GSH水平,并降低4-HNE蛋白表达和神经元线粒体萎缩。4、Pft-α可抑制SAH后HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表达水平升高。结 论第一部分1、大鼠SAH后24h大脑皮质神经元细胞出现铁死亡。2、p53、SLc7a11、GPx4可能参与SAH后铁死亡的调节。3、铁死亡可能促进DAMPs相关神经炎症。第二部分1、抑制铁死亡可以减少SAH后大脑皮质血脑屏障破坏、抑制DAMPs释放、减轻神经炎症、减少神经元细胞死亡,改善SAH后24h神经功能障碍和脑水肿,在EBI中发挥神经保护作用。2、Fer-1主要通过介导SAH后SLc7a11/GSH/GPx4轴水平升高,降低了脂质过氧化水平,减少了 SAH后大脑皮质神经元铁死亡。第三部分1、抑制SAH后大脑皮质p53的表达可介导SLc7a11/GSH/GPx4轴的水平升高,减少铁死亡的发生,减轻EBI。2、下调SAH后p53表达水平可以抑制铁死亡,从而减轻神经炎症反应,发挥脑功能保护作用。