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转录因子在多种细胞功能中担任了重要角色,包括细胞生长、增殖、凋亡和细胞内的信号转导。人们已经鉴定了几个大的转录因子家族。在哺乳动物中,含KRAB结构域的锌指蛋白(KRAB-ZFP)家族是人类基因中最大的一类转录因子,研究表明许多KRAB-ZFP基因与心脏发育以及心血管疾病都有关系。我们从人类胚胎心脏cDNA文库中克隆鉴定了一个锌指基因,经国际基因命名委员会批准命名为ZNF328。该基因全长4511bp,其开放阅读框(ORF)长2376bp,编码了792个氨基酸,在N端含有一个KRAB框,C端含有15个C2H2型锌指。ZNF328由8个外显子组成,在基因组上跨越大约28kb,其中外显子6、7分别编码了KRAB框的A和B框;ZNF328位于染色体带19q13.4上。Norternblot分析该蛋白在大部分的成体和胚胎组织中都有表达。亚细胞定位分析表明ZNF328蛋白定位在细胞核中。用Gal-4DNA结合系统对ZNF328进行转录分析,说明该基因是个转录抑制因子,结构域分段分析表明KRAB框起主要的抑制作用。在COS-7细胞中过表达ZNF328抑制了SRE和AP-1的转录活性,而这两种因子是MAPK信号途径介导的重要因子,说明ZNF328蛋白可能在MAPK信号途径中作为抑制因子介导细胞功能。为了观察新基因过表达后细胞蛋白质表达的改变,构建了pCMV-Tag2B-ZNF328真核表达载体,应用脂质体转染技术,将ZNF328基因导入HeLa细胞系中,通过G418筛选,并经PT-PCR鉴定,鉴定了稳定表达的细胞系。提取稳定转染细胞的总蛋白,采用双向凝胶电泳分离细胞蛋白质,软件分析统计ZNF328稳定转染细胞二维图谱的蛋白质点,并与转染空载体的细胞蛋白质点比较,结果表明该基因的稳定表达可导致Hela细胞的蛋白质表达谱的改变。综合该基因的结构和表达特征,本文初步得出结论认为:ZNF328基因是参与多种人类胚胎器官发生的锌指转录调控因子。
本文还研究了另外一个人类锌指蛋白家族新成员ZNF382的功能,将其开放阅读框克隆至pRSETC及pEGFP-N1表达载体中。诱导表达并用纯化的融合蛋白免疫家兔得到抗ZNF382的抗体。Westernblot结果显示这种抗体能特异地识别在原核表达系统内表达的抗原,并对人类胚胎组织中的ZNF382具有较高的特异性。