研究背景据全球癌症发病的最新统计资料显示肺癌的发病率居恶性肿瘤的首位,在我国情况也是如此。每年因为肺癌死亡的人数超过100万,是严重威胁人类健康的疾病。更另人担忧的是肺癌的发病率呈明显上升趋势,这与人口的老龄化、城市的工业化、农村的城市化、环境污染以及不良生活习惯如吸烟相关。根据肿瘤组织形态学的不同,肺癌主要分为小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC),后者包括腺癌、鳞癌和大细胞癌。SCLC发病率约占原发性肺癌的15%,分化程度低,易较早发生血行转移,预后极差。虽然SCLC对初始化疗比较敏感,但极易发生多药耐药(multi-drug resistance, MDR)现象,从而导致化疗失败,肿瘤进展较快,患者早期出现了复发与转移,最终因多器官功能衰竭而死亡,5年存活率不足5%。因此,SCLC的多药耐药性是目前SCLC基础应用研究和临床治疗亟待解决的问题之一。恶性肿瘤化疗治疗失败的主要原因是多药耐药,是指对已经接触过抗肿瘤药物无论在功能上或结构上都不相关的多种药物具有获得性耐药。肿瘤多药耐药机制主要有包括下面几种因素：(1)药理性耐药(pharmacological resistance):指由机体本身对药物的影响所导致的耐药,如药物进入机体后代谢活动增强或药物活化障碍,肿瘤组织血供不足,药物与组织亲透力差等；(2)微环境耐药(microenvironment resistance):指肿瘤细胞的存活和生长有赖于器官微环境,而器官微环境可以通过不同的耐药基因表达来影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性从而产生；(3)凋亡耐药(apoptosis resistance):参与控制的细胞凋亡基因如P53、BCL-2、C-myc等受到了抑制；(4)生化耐药(biochemical resistance):指肿瘤细胞的遗传性及生化特性发生变化,使细胞通过不同途径对药物产生耐药,其中研究最为广泛的是ABCC膜转运蛋白超家族成员即药物输出泵,如P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MP)、肺耐药相关蛋白(LRP)、谷胱甘肽转移酶等。这些蛋白既然参与肿瘤细胞的多药耐药,但是如何发现这些蛋白质,进行鉴定,并研究其作用机制以及想办法改变其功能是蛋白质组学研究的重要内容。细胞凋亡异常：凋亡逃逸是肿瘤细胞的共同特性,也是SCLC产生化疗抗性的重要原因。在细胞黏附介导的耐药中,胞外基质蛋白可对抗细胞毒性药物诱导的凋亡信号。细胞外基质(extracellular matrix, ECM)在β1整合素(β lintegrin)介导下,通过激活P13K信号通路,从而使下游靶区PKB、GSK3β表达增高,阻断细胞凋亡。CD9是四次跨膜蛋白Tetraspanin家族成员之一,在转移性SCLC组织以及顺铂或依托泊苷耐药的SCLC细胞系中具有高表达。CD9阳性的耐药SCLC细胞在β1整合素(β1integrin)的介导下,与纤连蛋白(fibronectin)的连接更为紧密,通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,引起肿瘤对化疗诱导的凋亡不敏感。使用靶向CD9的特异性单克隆抗体ALB6或小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)可成功触发上述耐药细胞发生凋亡。抑癌基因p53蛋白可应答DNA损伤信号,激活生长阻滞通路(抑制DNA修复)和凋亡通路。p53基因缺失或突变的肺癌患者预后不良,常伴有对放、化疗的抗性。在超过80%的SCLC中均发现野生型p53蛋白活性的缺失,通过抑制细胞周期依赖性激酶抑制剂p21wafl表达,引起细胞周期检查点异常,最终导致细胞增殖失控、凋亡受阻,与疾病进展、预后不良及化疗耐药相关。Bcl-2基因定位于染色体的18q21,编码相对分子质量为26000的蛋白,Bcl-2属凋亡调节基因家族成员。在SCLC中常有Bcl-2表达上调,体外诱导的耐药SCLC细胞系中亦可见Bcl-2表达增加。郭用microRNA芯片技术发现,小细胞肺癌耐药细胞株H69AR细胞与药物敏感细胞株H69细胞相比,有61种microRNA存在差别,其中24种表达增高,37种表达下调。48种microRNA首次报道与肿瘤的耐药相关,包括miR-134, miR-379与miR-495。用miR-134miR-379与miR-495的类似物转染到H69AR细胞中,其对DDP、ADM及VP-16的药物敏感性增加。进一步研究发现,miR-134调节的靶蛋白是MRPA/ABCC1,转染miR-134类似物MRPA/ABCC1蛋白表达下降,并且H69AR细胞对DDP、ADM及VP-16的药物敏感性。同源异型盒(homeobox)基因(HOXA1)是细胞分化、增殖和凋亡等生物学过程的关键调节基因,参与胚胎发育和个体生长的调节。有研究表明同源异形盒基因可以调节肿瘤的凋亡或耐药性。肖以SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69作为研究对象,采用cDNA基因芯片分析两株细胞中具有差异表达的基因,结果显示HOXA1在SCLC细胞株H69中的表达是多药耐药细胞株H69AR中的表达的4.16倍,实时荧光定量PCR结果和Western Blot检测结果验证了基因芯片的结果。上调HOXA1的表达明显增加H69AR细胞的药物敏感性,下调HOXA1的表达显著增加H69细胞的耐药性。免疫组化染色结果显示,HOXA1在存活患者中的阳性表达率为91.7%(11/12),在死亡患者中的阳性表达率为35.3%(18/51),两者的HOXA1阳性表达率具有统计学差异(x2=12.427, P<0.001), HOXA1阳性表达者生存时间显著高于HOXA1阴性表达患者。HOXA1是miR-100的靶基因,可受到miR-100调控,转染miR-100的抑制物,可使HOXA1表达增加,并增加H69细胞的耐药性。上皮和内皮细胞酪氨酸激酶(Epethelial and endothelial tyrosine kinase, Ekt)是BTK家庭中的重要成员之一,研究发现它在上皮增值、分化、凋亡和肿瘤发生过程中有着重要的调控作用。周应用荧光定量PCR和Western blot技术证实H69AR细胞中Ekt表达水平明显高于H69细胞,基因沉默降低H69AR中Ekt水平后,H69AR对阿霉素的敏感性显著增加,进一步证实Ekt有抵抗药物诱导细胞凋亡的作用,并且在小细胞耐药性产生过程可能有重要作用。细胞膜蛋白药泵表达异常：MDR的形成与膜蛋白如ABC家族成员P-gp、 MDR相关蛋白(MDR1、MRP1、MRP2)等的过度表达有关。在耐药的SCLC组织和体外培养SCLC细胞系中都发现P-gp和MRP-1表达水平的增高。MDR的形成也与LRP高度表达相关,它能介导以DNA为靶点的化疗药物,如阻止顺铂、卡铂等烷化剂进入细胞核,起到中间关卡的作用,组织药物进入细胞核内或者将已进入核内的药物通过转运载体重新运出细胞核或将细胞浆中的药物转运至运输囊泡,从而使药物呈房室性分布,并通过胞吐机制将药物排出细胞,降低细胞内的药物浓度,最终产生耐药。有学者从基因芯片证实FZD1、GLI1和FRZB在SCLC的耐药细胞株及呈现耐药现象的患者中显著高表达。FZD1是参与编码跨膜Wnt受体卷曲蛋白的基因。参与编码Wnt受体卷曲蛋白的基因共10种(FZD1～FZD10),其在恶性肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。该研究基因芯片证实FZD1无论在离体H69AR细胞还是活体内,都呈现出较高的表达水平。FZD1作为Wnt受体卷曲蛋白的重要编码基因可作为逆转SCLC多耐药的理想靶标。GLI是Sonic hedgehog(Shh)信号通路重要的转录因子。Shh信号通路在胰腺癌、基底细胞癌、SCLC等肿瘤中异常激活。Shh信号通路对靶细胞的作用是通过细胞膜上的Patched(PTC)(?)(?)2个转录原件所介导,最终激活一种转录因子GLI。化疗药物反复刺激Shh信号通路的上游基因,引发下游转录因子出现生物功能的改变。GLI1作为Shh信号通路的终点,充分说明GLI1不仅参与肿瘤的发生发展而且参与了肿瘤细胞对化疗药物的耐药。FRZB是Wnt信号通路的负性调节因子,该研究发现FRZB在SCLC的耐药细胞株及呈现耐药现象的患者中显著高表达,在细胞学研究中,耐药细胞株的表达显著高于亲本细胞株,说明该基因参与了肿瘤的耐药性。但这些基因的变化是如何参与肿瘤细胞的耐药以及如何避免这些耐药基因作用的发挥仍需要深层次的研究。细胞内酶系统异常：DNA拓扑异构酶(topoisomerase, Top)是细胞DNA复制和转录的主要核酶。Top抑制剂是SCLC最常用的化疗药物之一,Top表达水平下调以及表达类型的改变是SCLC对Top抑制剂耐药的重要原因。最近一项研究发现,脂质体介导的人工合成siRNA瞬时转染可有效抑制人小细胞肺癌细胞株H446的TopⅠ表达并显著提高对VP16的敏感性,提示转染后的细胞株TopⅠ水平下降的同时有Top Ⅱ的表达水平升高。体内、外实验均已经证实TopⅠ抑制剂和Top Ⅱ抑制剂联合应用时具有明显的协同作用。Lawson等通过cDNA芯片分析筛选SCLC耐药相关基因,并人为改变候选靶基因表达水平以观察其对SCLC药物敏感性的影响,结果发现,DNA聚合酶β (DNA polymerase β)和神经内分泌转录因子NKX的高表达可能与SCLC对依托泊苷的耐药有关,这一结论在SCLC组织芯片结果中亦得到证实。细胞修复系统增强：近年来研究表明,DNA错配修复(mismatch repair, MMR)在SCLC的获得性耐药中起着非常重要的作用。有学者发现MMR基因MLH1和MSH2的表达下调可能与SCLC的发生及其MDR有关。至于MMR基因表达下调的具体机制目前尚不清楚,可能与组蛋白去乙酰化、磷酸化或启动子超甲基化造成的MMR基因沉默有关。蛋白质学是肿瘤临床和基础研究中的热点,对于了解肿瘤尤其是发病机制,诊断和治疗等多方面都有重要作用。“蛋白质组学”则是应用大规模蛋白质分离和鉴定技术,从蛋白质水平探索生命的本质及其规律的一门学科,是高通量的蛋白质筛选技术。包括结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。蛋白质组学研究技术主要包括蛋白质分离技术、鉴定技术和生物信息学技术。蛋白质组学研究的样品可用细胞、组织、血液、体液等。近年来,激光捕获显微切割技术(LCM)的应用,既保证了肿瘤组织取材可获得足够量的单一细胞成分,也能保持细胞原有形态。蛋白质分离的关键技术是二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE),其原理是根据蛋白质等电点与分子量的不同,通过电泳的方式把蛋白质分离。蛋白质鉴定技术主要是质谱分析法(massspectrometry, MS),最常用的是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laserdesorption/ionization-time of flight-mass spectrometry, MALDI—TOF—MS)。质谱分析的原理是利用电离源将蛋白质转化为离子,然后借助于质谱仪的电场与磁场将具有特定质量与电荷比例(M/Z)的蛋白质分子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知的蛋白质。具有高分辨、高敏感、高通量及直接检测复杂的生物学样本等优点,已成为蛋白质组学研究的特色技术。生物信息学也是蛋白质组学研究的重要部分,其在蛋白质组学的研究中对构建和分析2-DE图谱,数据库的搜索与构建等方面有重要作用。蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。蛋白组学必须结合生物信息学才能在复杂的数据里提取有价值的信息,为研究工作提供有效指引。目的通过比较SCLC多药耐药细胞株(H69AR)和敏感细胞株(H69)中蛋白表达差异,从多种表达差异的蛋白中选取表达差异显著的蛋白DJ-1和confilin-1(CFL-1)进行进一步研究。利用RNA干扰技术下调此蛋白的表达水平,并观察耐药株对阿霉素(Doxorubicin，ADM)、顺铂(Csiplatin,DDP)、足叶乙甙(Etoposid,VP-16)等的药物敏感性变化；分析DJ-1和CFL-1在SCLC组织中表达以及与临床病理资料关系,探讨其作为SCLC治疗靶点和预后判断的生物学指标可能性,进一步丰富SCLC多药耐药性的分子机制,为临床治疗提供理论和实验依据。内容与方法一、分析SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69中蛋白组表达差异性以SCLC多药耐药细胞株H69AR和敏感细胞株H69作为研究对象,应用双相电泳(2D-PAGE)和质谱分析技术,分析两株细胞中具有差异表达的蛋白。从多种表达差异的蛋白质中选取表达差异显著的DJ-1与CFL-1进一步研究,采用Western Blot技术验证两种蛋白在两株细胞中的表达差异。二、利用RNA干扰技术下调DJ-1与CFL-1在H69AR细胞株的表达首先合成DJ-1与CFL-1的siRNA以及control siRNA,然后通过脂质体法转染H69AR细胞与H69细胞,培养24h后提取总蛋白。利用western blotting技术检测转染DJ-1-siRNA、CFL-1-siRNA和control siRNA组中DJ-1、CFL-1的蛋白表达差异。三、分析下调DJ-1与CFL-1表达后对H69AR细胞株耐药性的影响利用CCK-8法分析H69AR-DJ1-siRNA394细胞与H69AR-CFL1-siRNA523细胞对不同浓度的小细胞肺癌常用化疗药物阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、足叶乙苷(VP16)药物敏感性变化。四、DJ-1与CFL-1在SCLC组织中的表达及临床意义收集116例SCLC的石蜡包埋组织,患者平均年龄60岁(58.92±10.09),随访时间0-128月。其中男性101例,女性15例；年龄<60岁有58例,年龄≥60岁也是58例；临床分期局限期72例,广泛期46例；接受化疗或放疗95例,未进行化疗或放疗的21例。免疫组织化学染色S-P法检测SCLC组织中DJ-1与CFL-1的表达情况,并分析DJ-1与CFL-1的表达水平与临床病理特征及患者预后的关系。五、统计分析数据以均数±标准差(Mean±SD)表示,所有结果均经SPSS13.0统计软件处理。CCK8采用两因素析因设计的方差分析,多重比较用SNK法。同一组内不同浓度间比较和同一浓度不同组间比较用one-way ANOVA。参数比较前均先进行方差齐性检验,若方差不齐用基于方差不齐的近似F检验Welch法。免疫组化染色强度的比较采用Mann-Whitney U检验;小细胞肺癌组织中DJ-1与CFL-1表达水平与生存率的关系采用Kaplain-Meier分析。应用Chi-square test分析DJ-1与CFL-1表达水平与临床病理特征的关系。应用Cox回归模型分析分析DJ-1与CFL-1临床病理特征参数与SCLC患者预后的关系。以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、SCLC沛癌多药耐药细胞株H69AR与敏感细胞株H69中差异表达蛋白的筛选双相电泳分析发现有35蛋白质斑点在两组凝胶中有显著性差异表达,表达量相差两倍以上,其中在H69AR细胞中表达量升高的蛋白质斑点有25个,表达量下降的蛋白质斑点有10个。取25个表达量显著增高的斑点进行MALDI-TOF-MS分析,结果显示质谱鉴定最终得到16个H69AR/H69差异表达蛋白质,主要包括分子伴侣蛋白(HSPB1)、葡萄糖代谢酶(IMPDH2, Alpha-enolase)、细胞骨架蛋白(Cytoskeletal9, Cytoskeletal1, Cofilin-1)、钙结合蛋白(Annexin-A2、Sorcin、 S100A6)、细胞周期和凋亡相关蛋白(14-3-3epsilon, PCNA, Stathmin)及其它(Protein DJ-1, GIPC1,PPIA, vinculin)等。进一步采用Western blot验证多药耐药细胞株H69AR与敏感细胞株H69中DJ-1与CFL-1蛋白表达水平,结果发现H69AR细胞株中DJ-1与CFL-1蛋白水平显著高于H69细胞株。二、DJ-1与CFL-1siRNA干扰效率的鉴定针对DJ-1与CFL-1基因各设计3条siRNA (DJ-1-homo-394、DJ-1-homo-483、 DJ-1-homo-612; CFL-1-homo-326、CFL-1-homo-523、CFL-1-homo-579),在小细胞肺癌耐药细胞株H69AR中转染上述的siRNA以及control siRNA,结果显示转染DJ1-siRNA394与CFL1-siRNA523组DJ-1和CFL-1的表达水平下调最为显著,选取作为后续研究的siRNA。三、下调DJ-1与CFL-1表达后对SCLC多药耐药性的影响通过干扰技术下调DJ-1与CFL-1表达后,在H69AR细胞和H69细胞中DJ-1与CFL-1的表达水平明显下降。利用CCK-8法分析显示H69AR-DJ-1-siRNA394细胞对不同浓度的ADM (F=8981.090, P<0.001)、DDP (F=2670.697, P<0.001)、 VP16(F=2693.832, P<0.001)的生存率较mock组细胞的生存率明显降低。同样,H69AR-CFL1-siRNA523细胞对不同浓度的ADM、DDP、VP16的生存率较]mock组细胞的生存率也明显降低。四、DJ-1与CFL-1表达水平与SCLCI临床病理特征的关系(1)免疫组化染色显示DJ-1主要定位于肿瘤细胞质,在116例SCLC组织中,DJ-1蛋白阳性的60例,阳性率为51.7%(60/116),其中男性患者DJ-1中阳性表达率52.5%(53/101),女性患者中的阳性表达率为46.7%(7/15),两者阳性表达率的差异无显著性(X2=0.176,P=0.674)。60岁以下患者中DJ-1阳性表达率为53.4%(31/58),60岁以上患者中阳性表达率为50.0%(29/58),两者阳性表达率差异无统计学(X2=0.138,P=0.710)。局限期患者中DJ-1阳性表达率为52.8%(38/72),广泛期患者中阳性表达率为50.0%(22/44),两者的DJ-1阳性表达率差异无显著性(X2=0.084,P=0.771)。95例接受化疗患者中,DJ-1阳性表达率为50.5%(48/95),21例未接受化疗患者中阳性表达率为51.7%(12/21)，两者的DJ-1阳性表达率差异无显著性(χ2=0.302, P=0.583)。DJ-1在存活患者中的阳性表达率为15.4%(2/13),在死亡患者中的阳性表达率为57.1%(52/93),两者的DJ-1阳性表达率有显著性(X2=7.946,P=0.005)。(2)免疫组化染色显示CFL-1主要定位于肿瘤细胞质,116例SCLC组织中CFL-1阳性表达61例,阳性表达率为52.6%(61/116),其中在男性患者中CFL-1阳性表达率55.4%(56/101),在女性患者中的阳性表达率为33.3%(5/15),两者的阳性表达率差异无显著性(X2=2.561,P=0.110)。在60岁以下患者中CFL-1阳性表达率为51.7%(30/58),60岁以上患者中阳性表达率为53.4%(31/58),两者的CFL-1阳性表达率差异无显著性(X2=0.035,P=0.852)。局限期患者中CFL-1的阳性表达率为50.0%(36/72),广泛期患者中的阳性表达率为58.8%(25/44),两者的CFL-1阳性表达率差异无显著性(#=0.509,P=0.475)。在95例接受化疗的患者中CFL-1阳性表达率为51.6%(49/95),21例未接受化疗的患者中阳性表达率为51.7%(12/21),两者的CFL-1阳性表达率差异无显著性(X2=0.214,P=0.664)。在存活患者中CFL-1的阳性表达率为23.1%(3/13),在死亡患者中的阳性表达率为57.1%(52/93),两者的CFL1阳性表达率差异有显著性(X2=5.298,P<0.05)。五、SCLC患者预后因素分析Kaplan-Meier生存分析结果显示,DJ-1(10g-rank test,χ2:19.084,P<0.001)和CFL-1(log rank test,χ2=11.035,P=0.001)高表达预示SCLC预后不良。对116例SCLC病例进行单因素Cox回归分析,结果表明,DJ-1高表达(HR=2.509,P<0.001,95%CI:1.622-3.880)和CFL-1高表达(HR=2.000,P=0.001,95%CI:1.304-3.068)分别是SCLC预后不良的指标之一,此外接受化疗(HR=0.488,P:0.012,95%CI:0.278-0.856)也是SCLC的预后指标。Cox多重回归分析(Enter)表明,DJ-1高表达(HR:2.960,P=0.001,95%CI:1.519-5.767)是SCLC预后不良的独立指标之一,接受化疗是SCLC患者的保护性因素(HR=0.488,P=0.012,95%CI:0.278-0.856)。Cox回归全变量模型分析患者的性别、年龄、疾病分期、手术、化疗、转移、DJ-1及Confilin表达与患者预后的关系,发现DJ-1、手术治疗及疾病的转移与患者的预后相关。DJ-1高表达患者的预后较差,可作为独立的预后因子,差异具有统计学意义(W=13.594,P<0.001),高表达DJ-1患者的相对风险度为3.861,95%相对风险度的可信区间为1.883-7.919；无转移患者的相对风险度较转移患者降低,RR=0.414,95%相对风险度的可信区间为0.175-0.977,差异具有统计学意义(W=4.053,P=0.044),进行手术治疗患者的相对危险度为2.195，95%相对危险度的可信区间为1.275-3.776，差异具有统计学意义(W=8.057,P=0.005)。Cox回归逐步回归模型与全变量回归模型的结果一致结论1、应用蛋白质组学的双相电泳技术与质谱分析技术可筛查出SCLC多药耐药相关蛋白。2、DJ-1和CFL-1在SCLC多药耐药细胞株H69AR中高表达,而在药物敏感细胞株H69中低表达,下调DJ-1和CFL-1的表达可引起多药耐药细胞株H69AR对药物敏感性的变化,说明了DJ-1与CFL-1参与了SCLC的耐药。3、DJ-1和CFL-1在SCLC组织中表达与患者的生存时间相关,而与患者的性别、年龄、临床分期等无统计学意义,这两种蛋白有望成为SCLC患者的预后指标及药物治疗的靶点。