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目的：探讨脊髓背角SGK1-HDAC4-HMGB1信号通路是否参与SD大鼠Ⅱ型糖尿病神经病理性疼痛（DNP)的形成与发展。
方法：雄性SD大鼠（120-150g），高脂高糖饲料喂养后，测定大鼠热缩足潜伏期（TWL）和机械缩足阈值（MWT）作为大鼠的基础痛阈值。空腹12h，测空腹血清胰岛素敏感指数、血糖、血清胰岛素，随后予以腹腔注射链佐脲菌霉素（STZ）35mg/kg，3天后检测大鼠血糖，血糖≥16.7mmol/L的归为糖尿病大鼠（D组）。将血糖达标且MWT及TWL都降至基础痛阈值85%以下者归为DNP大鼠。血糖达标，而TWL及MWT均未降至基础痛阈值85%以下者，归为糖尿病非疼痛组（PL）即未诱发出疼痛者。将DNP大鼠随机分为3组，每组12只：DNP组、DNP+SGK1抑制剂GSK-650394（DNP+GSK）组、DNP+溶剂对照组（SC）。DNP+GSK组和SC组分别鞘内给予抑制剂GSK-650394(300nM,10μl)和10%DMSO，每日一次，连续14天。DNP和PL组不做给药处理。另取12只同批次SD大鼠作为正常组，喂养普通饲料。在DNP+GSK组、SC组连续鞘内给药的第3、7、14天，测定各组大鼠TWL、MWT后，各组随机取3只大鼠生理盐水灌注后处死，取L4-6脊髓腰膨大组织提取蛋白，用免疫印迹方法检测脊髓中SGK1、p-SGK1、HDAC4、p-HDAC4、14-3-3β、HMGB1的表达情况以及用胞核蛋白提取试剂盒对HDAC4分离提取，应用免疫印迹方法分析胞浆内HDAC4和胞核内HDAC4含量变化，另外3只用于免疫荧光检测相应蛋白的细胞定位。
结果：
1.血糖、胰岛素、胰岛素敏感指数改变情况：与正常饲料喂养的N组SD大鼠相比，高脂高糖饲料连续喂养8周的D组大鼠血糖升高但未达到糖尿病诊断标准即血糖≥16.7mmol/L（N组：4.8±0.7，D组：4.7±0.7），并且D组大鼠空腹12h后测得胰岛素浓度显著升高且有意义（N组：17.1±2.3，D组：39.0±1.6，P＜0.05），胰岛素敏感性指数也显著下降(N组：-4.35±0.13，D组：-5.12±0.23，P＜0.05)。
2.机械痛阈和热痛阈（MWT、TWL)变化：与N组和PL组比较，DNP组在STZ注射14天后及分组后的3、7、14天，MWT明显下降，TWL明显缩短(P＜0.05)，而在连续鞘内给予SGK1抑制剂GSK-650394的3、7、14天后，与DNP组相比,DNP+GSK组大鼠痛阈显著改善（P＜0.05)。
3.大鼠脊髓HDAC4,p-HDAC4在3个时间点表达情况：与N组和PL组相比，DNP组大鼠在分组后的3、7、14天时，脊髓中的HDAC4表达无明显改变（P＞0.05）。但p-HDAC4表达明显上调（P＜0.05），而N组和PL组大鼠的HDAC4,p-HDAC4比较，差异无统计学意义。
4.HDAC4免疫荧光共定位结果：免疫荧光双染显示HDAC4与脊髓后角神经元细胞标记物NeuN共定位，而与小胶质细胞标记物OX-42和星形胶质细胞标记物GFAP无共定位情况。
5.大鼠脊髓SGK1、p-SGK1免疫印迹结果：与N组和PL组相比，免疫印迹结果显示DNP组大鼠在分组后3、7、14天脊髓中p-SGK1/SGK1明显增多（P＜0.05），而N组和PL组相比，该比值无统计学意义。
6.SGK1通过诱导HDAC4的磷酸化/核内外移位参与大鼠DNP的调节：鞘内连续给予SGK1特异性抑制剂GSK-6503943、7、14天后，DNP+GSK组p-SGK1/SGK1与DNP组相比较明显下调（P＜0.05），TWL明显延长，MWT明显升高（P＜0.05）。而给予10%DMSO的溶剂组（SC组）与DNP组相比较，p-SGK1/SGK1表达改变无统计学意义,TWL和MWT的改变也无统计学意义。同时，当连续鞘内给予SGK1抑制剂GSK-6503943、7、14天后p-HDAC4表达明显下调（P＜0.05），而SC组与DNP组相比较，p-HDAC4表达改变无统计学意义。此外根据行为学和p-HDAC4免疫印迹结果,选取了STZ注射后21天的脊髓组织进行HDAC4的胞核胞质提取实验。与N组和PL组相比，DNP组大鼠脊髓中的胞质HDAC4/胞核HDAC4比值明显升高（P＜0.05）,而连续给予SGK1抑制剂GSK-6503947天后,该比值明显下调（P＜0.05），而SC组与DNP组相比较比值改变无统计学意义。说明SGK1可能参与HDAC4的激活和胞核内移位。
7.SGK1与HDAC4共定位于神经元细胞：SGK1与脊髓后角神经元细胞标记物NeuN共定位，意味着SGK1表达于脊髓后角神经元细胞，并且HDAC4与SGK1共定位，说明神经元细胞上SGK1和HDAC4可能存在直接相互作用。
8.脊髓HMGB1表达的变化：同上，也选取STZ注射后21天的脊髓组织测定HMGB1表达改变情况。与N组和PL组相比，DNP组HMGB1表达显着升高（P＜0.05）。N组与PL组之间无显着差异。但与DNP组相比，分组后7天的DNP+GSK组HMGB1水平显着下调（P＜0.05）。SC组和DNP组之间没有显着差异。
9.脊髓14-3-3β免疫印迹结果：与N组和PL组相比，免疫印迹结果显示DNP组大鼠3、7、14天脊髓中14-3-3β表达明显上调（P＜0.05）。而N组和PL组比，无统计学意义。但连续给予SGK1特异性抑制剂GSK-6503943、7、14天后，DNP+GSK组的14-3-3β表达与DNP组相比无明显变化（P＞0.05）。SC组14-3-3β的表达与DNP组中14-3-3β的表达比较，差异也无统计学意义。
10.HDAC4与14-3-3β共定位于神经元细胞：HDAC4与脊髓后角神经元细胞标记物NeuN共定位，意味着HDAC4表达于脊髓神经元细胞，并且HDAC4与14-3-3β完全共定位，说明神经元细胞上14-3-3β和HDAC4可能存在相互联系。
结论：Ⅱ型糖尿病神经病理性疼痛大鼠机械缩足阈值下降和热缩足潜伏期缩短，p-SGK1/SGK1的比值增高，导致HDAC4的磷酸化增强。胞质中的14-3-3β作为磷酸化结合蛋白，能够与p-HDAC4相结合，使HDAC4滞留在胞质中。因HDAC4负调节转录，HDAC4的胞核胞质转移可能解除了HDAC4对胞核内HMGB1基因的抑制,导致脊髓HMGB1表达增多，从而引起神经病理性疼痛的发生。
方法：雄性SD大鼠（120-150g），高脂高糖饲料喂养后，测定大鼠热缩足潜伏期（TWL）和机械缩足阈值（MWT）作为大鼠的基础痛阈值。空腹12h，测空腹血清胰岛素敏感指数、血糖、血清胰岛素，随后予以腹腔注射链佐脲菌霉素（STZ）35mg/kg，3天后检测大鼠血糖，血糖≥16.7mmol/L的归为糖尿病大鼠（D组）。将血糖达标且MWT及TWL都降至基础痛阈值85%以下者归为DNP大鼠。血糖达标，而TWL及MWT均未降至基础痛阈值85%以下者，归为糖尿病非疼痛组（PL）即未诱发出疼痛者。将DNP大鼠随机分为3组，每组12只：DNP组、DNP+SGK1抑制剂GSK-650394（DNP+GSK）组、DNP+溶剂对照组（SC）。DNP+GSK组和SC组分别鞘内给予抑制剂GSK-650394(300nM,10μl)和10%DMSO，每日一次，连续14天。DNP和PL组不做给药处理。另取12只同批次SD大鼠作为正常组，喂养普通饲料。在DNP+GSK组、SC组连续鞘内给药的第3、7、14天，测定各组大鼠TWL、MWT后，各组随机取3只大鼠生理盐水灌注后处死，取L4-6脊髓腰膨大组织提取蛋白，用免疫印迹方法检测脊髓中SGK1、p-SGK1、HDAC4、p-HDAC4、14-3-3β、HMGB1的表达情况以及用胞核蛋白提取试剂盒对HDAC4分离提取，应用免疫印迹方法分析胞浆内HDAC4和胞核内HDAC4含量变化，另外3只用于免疫荧光检测相应蛋白的细胞定位。
结果：
1.血糖、胰岛素、胰岛素敏感指数改变情况：与正常饲料喂养的N组SD大鼠相比，高脂高糖饲料连续喂养8周的D组大鼠血糖升高但未达到糖尿病诊断标准即血糖≥16.7mmol/L（N组：4.8±0.7，D组：4.7±0.7），并且D组大鼠空腹12h后测得胰岛素浓度显著升高且有意义（N组：17.1±2.3，D组：39.0±1.6，P＜0.05），胰岛素敏感性指数也显著下降(N组：-4.35±0.13，D组：-5.12±0.23，P＜0.05)。
2.机械痛阈和热痛阈（MWT、TWL)变化：与N组和PL组比较，DNP组在STZ注射14天后及分组后的3、7、14天，MWT明显下降，TWL明显缩短(P＜0.05)，而在连续鞘内给予SGK1抑制剂GSK-650394的3、7、14天后，与DNP组相比,DNP+GSK组大鼠痛阈显著改善（P＜0.05)。
3.大鼠脊髓HDAC4,p-HDAC4在3个时间点表达情况：与N组和PL组相比，DNP组大鼠在分组后的3、7、14天时，脊髓中的HDAC4表达无明显改变（P＞0.05）。但p-HDAC4表达明显上调（P＜0.05），而N组和PL组大鼠的HDAC4,p-HDAC4比较，差异无统计学意义。
4.HDAC4免疫荧光共定位结果：免疫荧光双染显示HDAC4与脊髓后角神经元细胞标记物NeuN共定位，而与小胶质细胞标记物OX-42和星形胶质细胞标记物GFAP无共定位情况。
5.大鼠脊髓SGK1、p-SGK1免疫印迹结果：与N组和PL组相比，免疫印迹结果显示DNP组大鼠在分组后3、7、14天脊髓中p-SGK1/SGK1明显增多（P＜0.05），而N组和PL组相比，该比值无统计学意义。
6.SGK1通过诱导HDAC4的磷酸化/核内外移位参与大鼠DNP的调节：鞘内连续给予SGK1特异性抑制剂GSK-6503943、7、14天后，DNP+GSK组p-SGK1/SGK1与DNP组相比较明显下调（P＜0.05），TWL明显延长，MWT明显升高（P＜0.05）。而给予10%DMSO的溶剂组（SC组）与DNP组相比较，p-SGK1/SGK1表达改变无统计学意义,TWL和MWT的改变也无统计学意义。同时，当连续鞘内给予SGK1抑制剂GSK-6503943、7、14天后p-HDAC4表达明显下调（P＜0.05），而SC组与DNP组相比较，p-HDAC4表达改变无统计学意义。此外根据行为学和p-HDAC4免疫印迹结果,选取了STZ注射后21天的脊髓组织进行HDAC4的胞核胞质提取实验。与N组和PL组相比，DNP组大鼠脊髓中的胞质HDAC4/胞核HDAC4比值明显升高（P＜0.05）,而连续给予SGK1抑制剂GSK-6503947天后,该比值明显下调（P＜0.05），而SC组与DNP组相比较比值改变无统计学意义。说明SGK1可能参与HDAC4的激活和胞核内移位。
7.SGK1与HDAC4共定位于神经元细胞：SGK1与脊髓后角神经元细胞标记物NeuN共定位，意味着SGK1表达于脊髓后角神经元细胞，并且HDAC4与SGK1共定位，说明神经元细胞上SGK1和HDAC4可能存在直接相互作用。
8.脊髓HMGB1表达的变化：同上，也选取STZ注射后21天的脊髓组织测定HMGB1表达改变情况。与N组和PL组相比，DNP组HMGB1表达显着升高（P＜0.05）。N组与PL组之间无显着差异。但与DNP组相比，分组后7天的DNP+GSK组HMGB1水平显着下调（P＜0.05）。SC组和DNP组之间没有显着差异。
9.脊髓14-3-3β免疫印迹结果：与N组和PL组相比，免疫印迹结果显示DNP组大鼠3、7、14天脊髓中14-3-3β表达明显上调（P＜0.05）。而N组和PL组比，无统计学意义。但连续给予SGK1特异性抑制剂GSK-6503943、7、14天后，DNP+GSK组的14-3-3β表达与DNP组相比无明显变化（P＞0.05）。SC组14-3-3β的表达与DNP组中14-3-3β的表达比较，差异也无统计学意义。
10.HDAC4与14-3-3β共定位于神经元细胞：HDAC4与脊髓后角神经元细胞标记物NeuN共定位，意味着HDAC4表达于脊髓神经元细胞，并且HDAC4与14-3-3β完全共定位，说明神经元细胞上14-3-3β和HDAC4可能存在相互联系。
结论：Ⅱ型糖尿病神经病理性疼痛大鼠机械缩足阈值下降和热缩足潜伏期缩短，p-SGK1/SGK1的比值增高，导致HDAC4的磷酸化增强。胞质中的14-3-3β作为磷酸化结合蛋白，能够与p-HDAC4相结合，使HDAC4滞留在胞质中。因HDAC4负调节转录，HDAC4的胞核胞质转移可能解除了HDAC4对胞核内HMGB1基因的抑制,导致脊髓HMGB1表达增多，从而引起神经病理性疼痛的发生。