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目的:将通过反转录PCR获得的EB病毒基因LMP2A与人源性GM-CSF基因进行融合,获得高效、稳定表达EB病毒的LMP2A抗原蛋白及GM-CSF因子的融合基因;将融合基因导入卡介苗(BCG),获得的重组BCG(r BCG)比对照常规BCG具有强的抗EB阳性肿瘤细胞的特性。方法:利用分子生物学技术中的RT-PCR方法分别获得EB病毒基因LMP2A与人GM-CSF基因编码序列的c DNA,用剪接式重叠延伸技术,将两段基因通过多肽接头(Gly4Ser)3DNA序列连接以获得融合基因GCA,将融合基因与已经获得的分泌型大肠杆菌-BCG穿梭表达载体p MV261连接,热激法转化E.coli.DH5α;利用质粒p MV261的Kan+筛选阳性菌株,并对阳性菌株分别用PCR扩增、双酶切及DNA测序鉴定;提纯重组质粒p MVGCA,将融合基因GCA与已经获得的分泌型BCG穿梭表达载体p MV261连接。利用电穿孔技术将重组质粒p MV261-GCA导入BCG,构建r BCG-GCA;利用质粒的抗性位点筛选阳性菌株,并对阳性菌株分别用PCR扩增和限制性酶切实验,检测目的基因的整合与转录,Middlebrook 7H9液体培养基大量培养制备r BCG-GCA,用Western Blot鉴定培养上清中GCA的融合蛋白表达。培养EB病毒阳性肿瘤细胞鼻咽癌细胞株SUNE1-LMP2细胞,制成肿瘤细胞单细胞悬液,用其建立BALB/C小鼠皮下EBV阳性肿瘤移植瘤模型,然后将r BCG-GCA菌株肿瘤局部皮下注射,于重组菌注射肿瘤细胞后第6、9、12、15、18、21天,观察并测量小鼠的肿瘤大小,设置PBS、p MV261载体、BCG组作为对照进行研究分析。成瘤时间以及肿瘤的体积、重量采用随机单因素方差分析(采用SPSS11.5软件)。两者之间进行t检验,以P<0.05差异有统计学意义。结果:EB病毒基因LMP2A与人GM-CSF基因编码序列的c DNA经PCR鉴定与测序鉴定,与NCBI已报告的基因序列一致,将EB病毒基因LMP2A与人GM-CSF基因融合后,构建的融合基因经双酶切鉴定与测序鉴定,与理论值一致;将融合基因插入重组质粒p MV261,重组质粒p MV261经双酶切及测序鉴定插入正确,Ag85B基因和融合基因均能正确插入质粒p MV261,通过鉴定获得139bp的信号肽序列和1961bp的融合基因序列;将重组BCG培养后,取上清进行Western Blot分析,结果表明r BCG能分泌表达GM-CSF及LMP2A细胞因子;构建的重组BCG进行体内抗肿瘤实验,组成瘤时间最长(18d),与PBS组成瘤时间(8d)之间的差异有统计学意义(P<0.05),r BCG对肿瘤的平均抑瘤率可达82%,与PBS组相比,差异有统计学意义(p<0.05);结果表明重组BCG可抑制动物体内EB病毒阳性肿瘤细胞的生长。结论:EB病毒基因LMP2A与人源性GM-CSF融合基因GCG构建正确并能插入BCG分泌表达载体p MV261,电转化导入BCG后,重组质粒可在BCG中分泌性表达,表达的蛋白能被LMP2A抗体(或GM-CSF抗体)识别;重组BCG可抑制动物体内EB病毒阳性肿瘤细胞的生长;该实验为改造BCG、进行EB病毒相关肿瘤的免疫研究奠定了基础。