基于转录组测序的核桃花芽性别分化相关基因筛选及初步功能鉴定

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核桃(Juglans regia L)是胡桃科胡桃属木本植物,具有优秀的经济价值和营养价值。然而在花芽分化过程中,核桃花芽性别分化的数量不均等,雌花数量远远少于雄花的数量,并且雄花分化及发育过程中消耗了大量的树体养分,进一步限制了雌花的生长发育,导致坐果率低,严重影响了其经济效益,因此,为了解决这一问题,调控花芽分化过程具有实际应用价值。本研究主要从分子层面研究核桃有关花发育的分子机理,从而调控花芽分化的方向,进而解决核桃雌雄花数量的问题。AGAMOUS(AG)基因是调控雄蕊和心皮发育的关键基因,FLOWERING LOCUST(FT)基因是开花时间调控基因,这两个基因在花发育过程中起着非常重要的作用。因此研究核桃中AG基因和FT基因的功能对了解核桃的花芽分化以及开花调控有重要意义。主要结果如下:1.对核桃不同时期雌雄花芽进行转录组测序,得到177.4G的原始数据,通过对原始数据的过滤和筛选,每个样品的有效数据达到93%以上。本实验筛选出核桃雌雄花芽间差异表达基因共2167个,其中1005个上调表达基因,1162个下调表达基因;不同时期雌花芽的差异表达基因共1321个,上调表达基因671个,下调基因650个;不同时期雄花芽的差异表达基因1443个,上调表达基因662个,下调基因781个。通过GO功能分析和KEGG代谢通路分析,发现差异基因多富集在植物激素信号转导,有机物质合成,光合作用,糖代谢等途径。根据差异基因表达分析结果,结合GO和KEGG富集分析以及记载与花发育相关基因的文献,筛选出18个可能调控花芽分化的基因,通过荧光定量PCR验证基因表达量,结果与转录组测序结果相符。2.本实验克隆了核桃中两个AG基因和一个FT基因,分别命名为Jr AG1、Jr AG2和Jr FT。Jr AG1基因编码区全长768bp,预测编码氨基酸长度为255个氨基酸,理论p I值为9.14,蛋白不稳定系数为56.77,推测为不稳定蛋白,总平均亲水性为-0.577,预测为亲水性蛋白,进化树分析显示与光皮桦的亲缘关系最近;Jr AG2基因编码区全长747bp,预测编码氨基酸长度为248个氨基酸,理论p I值为8.98,蛋白不稳定系数为59.71,推测为不稳定蛋白,总平均亲水性为-0.712,预测为亲水性蛋白,进化树分析显示与枣树的亲缘关系最近。Jr AG1和Jr AG2都拥有MADS-box的MIKC结构域以及AG家族独有的AG I和AG II基序。Jr FT基因编码区全长525bp,预测编码氨基酸长度为174个氨基酸,内含一个PEBP结构域,理论p I值为6.73,蛋白不稳定系数为46.28,推测为不稳定蛋白;总平均亲水性为-0.391,预测为亲水性蛋白,进化树分析显示与八仙花的亲缘关系最近。3.本实验构建了Kpn I/Bam HI双酶切2301s::Jr AG1,Kpn I单酶切2301s::Jr AG2和Kpn I/Bam HI双酶切2301::Jr FT植物超表达载体,转化模式植物拟南芥进行功能验证。通过分子水平上的鉴定初步证实基因转入拟南芥中。表型观测发现,Jr AG1的转基因植株出现雄蕊发育异常,导致不能结果,Jr FT的转基因植株有早花性状。这些结果说明这些基因与花发育相关。
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