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背景:在香蕉基因组18个ACC氧化酶(ACC Oxidase)同源基因中,存在Mh-ACO1和Mh-ACO2两个基因参与乙烯果实后熟。本研究通过构建Mh-ACO1和Mh-ACO2靶基因的siRNA发卡结构表达载体,采用土壤农杆菌介导法整合到香蕉基因组中,并对Mh-ACO1 RNAi和Mh-ACO2 RNAi转基因香蕉植株进行Southern blot分析验证。为了深入了解Mh-CO1和Mh-ACO2之间功能的多样性和复杂性,首次采用Illimina次世代测序对香蕉第3期成熟果实转录组进行测序。结果:分别提取三个香蕉果实样本的总RNA并构建各自的cDNA文库,利用第二代高通量Illumina HiSeqTM2500测序技术,分别获得对照组、Mh-ACO1沉默转基因植株和Mh-AC02沉默转基因植株高质量干净读数:20068587、16046988和16279746,再对三个样本共同进行组装,总共获得32093976条reads,并将获得的123617条转录本组装成88031条Unigenes。非转基因香蕉植株(WT)、Mh-ACO1沉默转基因香蕉植株(As1)和Mh-AC02沉默转基因香蕉植株(As2)各样本分别获得的reads比重为78.50%、79.45%和79.99%,总 Unigenes 与已知蛋白数据库 NR(42325,42.8%)、NT(42325,48.07%)、GO(24411,27.73%)、Swiss-Prot(24931,28.32%)、KOG(12031,13.66%)、KEGG(12163,13.81%)和 PFAM(24104,27.38%)数据库比对后,6300条Unigene比对到上述七个数据库,46904条Unigene至少比对到一个数据库。随后对WT、As1和As2样本之间的差异基因(DEGs):As1-vs-WT(3050)、As2-vs-WT(2784)和As1-vs-As2(943)进行比较,并对其差异基因的GO(Gene Ontology)功能及 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能进行富集分析。发现GO注释的条目和样本DEGs主要富集在‘催化活性’(Catalytic activity)(1327,56.4%)、‘血红素结合’(Heme binding)(65,2.76%)、‘四吡咯结合’(Tetrapyrrole binding)(66,2.81%)和’氧化还原酶活性’(Oxidoreductase activity)(287,12.21%)。根据KEGG注释,大部分DEG主要富集在’光合生物固氮’(Carbon fixation in photosynthetic organisms)(30,22.73%)、’半胱氨酸和甲硫氨酸代谢’(Cysteine and methionine metabolism)(32.21,21.19%)、’柠檬酸循环’(Citrate cycle,TCA cycle)(25,22.73%)和‘淀粉与蔗糖代谢’(Starch and sucrose metabolism)(49,16.67%)。为了加深在分子水平上对香蕉果实后熟的理解,本研究对参与香蕉乙烯生物合成和信号转导相关的基因进行全面的研究,并对香蕉果实成熟第3期过程中碳水化合物代谢途径深入探讨。在本项转录组分析研究中发现,高通量测序的大部分序列重叠群(Contigs)显示与香蕉果实成熟第3期相似。为了验证Mh-ACO1 RNAi和Mh-ACO2 RNAi转基因香蕉植株在果实成熟第1、3、5和7期中相关基因参与乙烯的生物合成和信号转导的表达谱,分别对Mh-ACO1 RNAi和Mh-AC02RNAi转基因香蕉果皮和果肉进行实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析。结果显示,基于qRT-PCR所选择的基因与高通量测序水平检测的基因的表达水平显示一致,且果皮和果肉中WT、As1和As2香蕉样本之间有意义的基因表达水平相似。这些结果解释了可以通过调控果皮和果肉中乙烯生物合成和信号转导相关基因来影响香蕉果实成熟,并且香蕉果实成熟过程中参与乙烯生物合成相关基因的表达极大影响了乙烯信号转导相关的基因的表达水平。结论:本论文所采用的策略将提供一个有效分析果实成熟过程中相关基因的功能和网路通路,其转录组分析结果将有助于未来香蕉功能基因组的研究。通过对三个样本转录组进行测序,完成数字化基因表达DEG数据库组建,并为ACC氧化酶调控香蕉乙烯生物合成和碳水化合物代谢途径提供了宝贵的新数据,也为后续香蕉功能基因分析和研究奠定了基础。