小型猪作为实验动物模型被广泛应用在人类解剖学、生理学、生物化学、疾病发生机理和异种器官移植供体等方面的研究。小型猪的麻醉和催醒是保证相关领域科研工作顺利进行的必要保证,基于此本课题组经过系列科学试验研制出小型猪复合麻醉剂(XFM)和小型猪特异性麻醉颉颃剂。上个世纪在全麻机理研究中脂质学说占具着重要地位,但随着麻醉机理研究的不断深入蛋白质学说及基因学说的不断发展与完善,研究发现麻醉后一些快表基因出现表达量的改变,提示着基因变化与麻醉药效之间存在着积极的联系;同时又研究发现GABA受体及编码该受体蛋白的基因与全身麻醉有着密切的关系,因此从蛋白质及基因角度对麻醉及催醒机理的研究越来越为重要。PI3K/Akt及其下游激酶P70S6K细胞信号转导通路是一条经典的信息传递通路,通路中的关键分子Akt是细胞损伤后存活的关键环节。尽管对PI3K/Akt信号通路的研究多集中在对器官或组织缺血后损伤的保护方面,但有研究发现PI3K不仅能够影响细胞内钙库释放Ca2+从而影响细胞内钙离子水平,还能够间接性地被α2肾上腺素受体激活。因此,为了全面了解小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒XFM麻醉的中枢作用机制,更好地指导临床用药,本实验利用分子生物学技术,从PI3K/Akt信号通路入手,研究小型猪复合麻醉剂及其特异性颉颃剂对PI3K/Akt信号通路的关系,明确该通路在XFM麻醉与催醒中的交互作用机制。本研究中采用78只Wistar大鼠,随机分为麻醉组(AG组)(n=30)、催醒剂组(W组)(n=18)和麻醉后催醒组(AW组)(n=30)。麻醉组(AG组)又随机均分为5个亚组,分别为麻醉对照组(CG1组)、麻醉后翻正反射消失即刻组(AG1组)、麻醉后翻正反射消失1h(AG2组)、自然苏醒翻正反射恢复(AG3组)和自然苏醒翻正反射恢复(AG4组);催醒剂组(W组)又随机均分为3个亚组,分别为催醒对照组(CG2组)、注射颉颃剂后5分钟(W1组)和注射颉颃剂后1 h(W2组);麻醉后催醒组(AW组)又随机均分为5个亚组,分别为催醒对照组(CG3组)、早期催醒I组(AW1组)、早期催醒II组(AW2组)、晚期催醒I组(AW3组)和晚期催醒II组(AW4组),每个亚组大鼠6只。各实验组大鼠腹腔注射小型猪复合麻醉剂或小型猪特异性麻醉颉颃剂,分别在个时间点断头,采集大脑,分离大脑皮层、丘脑、海马、脑干及小脑。脑组织样品经过处理后,利用荧光定量PCR技术测定样品中PI3K/Akt信号通路及下m TOR和P70S6K m RNA转录水平,利用Western Blot技术测定通路中蛋白表达量,研究小型猪复合麻醉剂及其特异性颉颃剂对大鼠不同脑区PI3K/Akt信号通路蛋白表达及m RNA转录的影响,试验结果如下:1.小型猪复合麻醉剂及其特异性颉颃剂对PI3K蛋白表达及mRNA转录的影响小型猪复合麻醉剂明显激活大鼠脑内大脑皮层、海马、丘脑内PI3K蛋白表达和m RNA转录,蛋白水平和m RNA转录变化较为一致;单独注射小型猪特异性麻醉颉颃剂能够明显抑制大脑皮层、海马及脑干内PI3K蛋白表达及mRNA转录;使用小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒XFM麻醉大鼠后,大鼠脑内大脑皮层、海马及脑干内PI3K蛋白表达及mRNA转录受到显著抑制,表明小型猪复合麻醉剂的全麻作用可能与诱导特定脑区PI3K蛋白及m RNA表达有关,小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒作用可能与其在特定脑区逆转XFM对PI3K的诱导激活有关。2.小型猪复合麻醉剂及其特异性颉颃剂对Akt蛋白表达及m RNA转录的影响大鼠脑内大脑皮层、海马、脑干内Akt蛋白表达和m RNA转录在麻醉后显著升高,且蛋白表达与m RNA转录存在一定相关性;单独注射小型猪特异性麻醉颉颃剂明显抑制海马及脑干内Akt蛋白表达及m RNA转录;使用小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒XFM麻醉大鼠后,大鼠脑内海马及脑干内Akt蛋白表达及mRNA转录受到显著抑制,表明小型猪复合麻醉剂的全麻作用可能与诱导特定脑区Akt蛋白及m RNA表达有关,小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒作用可能与其在特定脑区逆转XFM对PI3K的诱导激活有关。3.小型猪复合麻醉剂及其特异性颉颃剂对mTOR蛋白表达及mRNA转录的影响小型猪复合麻醉剂明显激活大鼠脑内大脑皮层、海马内m TOR蛋白表达和mRNA转录;颉颃剂能够明显抑制海马及丘脑内m TOR蛋白表达及mRNA转录;使用小型猪特异性麻醉颉颃剂早期催醒XFM麻醉大鼠后,大鼠脑内大脑皮层、海马及脑干内PI3K蛋白表达及m RNA转录受到显著抑制,晚期催醒、海马、丘脑内m TOR蛋白表达及m RNA转录受到显著抑制表明小型猪复合麻醉剂的全麻作用可能与诱导特定脑区m TOR蛋白及m RNA表达有关,小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒作用可能与其在特定脑区逆转XFM对m TOR的诱导激活有关。4.小型猪复合麻醉剂及其特异性颉颃剂对P70S6K蛋白表达及m RNA转录的影响小型猪复合麻醉剂明显激活大鼠脑内大脑皮层、丘脑、脑干内P70S6K蛋白表达和m RNA转录,小型猪特异性麻醉颉颃剂能够明显抑制海马及丘脑内P70S6K蛋白表达及mRNA转录;使用小型猪特异性麻醉颉颃剂催醒XFM麻醉大鼠后,大鼠脑内大脑皮层、丘脑内PI3K蛋白表达及m RNA转录受到显著抑制,表明小型猪复合麻醉剂的全麻作用可能与诱导特定脑区P70S6K蛋白及mRNA表达有关,小型猪特异性麻醉颉颃剂的催醒作用可能与其在特定脑区逆转XFM对P70SK的诱导激活有关。综上所述:(1)小型猪复合麻醉剂麻醉对PI3K/Akt信号通路及下游信号分子具有一定的激活作用,这种激活在大鼠大脑皮层、海马,特定脑区较为明显,这可能是该通路参与麻醉作用的靶位之一。(2)小型猪特异性麻醉颉颃剂能够抑制大鼠脑内对PI3K/Akt信号通路及下游信号分子,对脑内海马区及丘脑区信号通路及下游信号分子的抑制作用较为明显,颉颃剂催醒效能的发挥可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路来实现的。(3)小型猪复合麻醉剂与颉颃剂对PI3K/Akt信号通路及下游分组的作用相反,这可能是小型猪复合麻醉剂及其颉颃剂的交互作用机制之一,但颉颃剂未能完全拮抗麻醉剂对大鼠脑内PI3K/Akt信号通路及下游分子的激活,提示全麻机理研究的复杂性和多位点性。