促红细胞生成素(Erythropoietin, EPO)是一类重要的造血生长因子,主要由肾脏分泌产生。具有促进红细胞增殖和分化,提高红细胞运输氧的功能。近年随着基因工程等生物技术的迅速发展,人们可以在哺乳动物细胞株中实现EPO基因的转染,由此可获得大量具有生物活性的重组人促红细胞生成素(rHuEPO)。rHuEPO类制剂中的rHuEPO-α和rHuEPO-β在临床上广泛用于治疗肾性贫血和癌症化疗引起的贫血症状。基于rHuEPO具有提高红细胞运输氧的药理功能,在耐力比赛中,存在运动员滥用此类药物以提高比赛成绩的可能性,因此世界反兴奋剂组织(WADA)的违禁药物清单中已明确将其列为肽类激素兴奋剂。目前开展的针对rHuEPO的检测方法,主要基于抗体作为传感或富集元件,以免疫分析或质谱分析为手段实现rHuEPO的检测。但抗体自身具有批间差异性、免疫原性和热不稳定性的局限性,将会阻碍目前基于抗体的免疫分析方法的特异性和灵敏度的提高。因此,针对抗体外新识别元件的研制,将对rHuEPO的分析检测提供更加有效的新思路和新途径。适配体是一类可折叠形成一定三维结构用于特异性识别靶分子的单链DNA,RNA或修饰后的核酸分子,与抗体有类似的识别特性,但较抗体相比特异性更强,并具有无免疫原性、易从体外化学途径制备、及热稳定性更强的优点,这就为开发rHuEPO-α的高亲和力、高特异性适配体提供了新思路。因此实验设计采用凝集素导向的指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,从全长80个碱基的单链脱氧寡核苷酸文库中,经8轮反复富集,成功筛选获得特异性识别rHuEPO-α的寡核苷酸适配体。并对筛选得到的部分高亲和力、高特异性的适配体进行结构分析。最终,基于具有天然茎环式二级结构的适配体807-39 nt,建立了一种新型的适配体型分子信标检测策略,实现rHuEPO-α的高灵敏度高特异性的检测。本论文共分为四章。第一章为文献综述,从促红细胞生成素的功能／用途及研究概况、SELEX筛选技术的发展、分子信标的原理及设计策略三方面进行概括,引用文献115篇。第二章详细介绍了rHuEPO-α的特异性寡核苷酸适配体的筛选过程。实验中采用凝集素导向的亲和树脂SELEX技术,将rHuEPO-α的唾液酸糖基部分固定后,实现针对其氨基酸序列的筛选,经N-乙酰葡萄糖胺特异性洗脱寡核苷酸与蛋白的复合物,经过8轮筛选后各轮(收敛)寡核苷酸文库的富集效率由13.8%提高到64.0%,同时各轮文库对于rHuEPO-α的选择性也由1.4增加到10.6。随后,对于第8轮富集文库的单克隆序列进行了序列比对分析,主要可以分为四个家族。Mfold模拟所得序列的二级结构主要呈现三大特征：紧密的茎环结构、多分支的茎环结构、少或无茎环结构。其中部分单克隆适配体的解离常数在几十nM到几百nM之间,亲和力最高的为适配体807(Kd=82±32 nM)。第三章为rHuEPO-α的特异性寡核苷酸适配体的截短序列研究。对于具有相对较低的吉布斯自由能和较低解离常数的适配体807和813,进行了进一步序列截短分析研究,以优化和寻求最短的有效结合序列长度。在第8轮文库中所占比例最高的序列807,其完全随机区807-39nt具有紧密的茎环结构,解离常数低于全长序列807,说明807-39nt的茎环结构对于复合物的形成有着重要作用。序列813的最短有效截短长度为813-42nt,其3’引物端的部分序列参与了随机区的茎部配对,并有利于复合物的形成。适配体807-39nt具有发卡式二级结构,主要由一富含G碱基的环部和长度为5对碱基的茎部组成。对于其茎部／环部的系列长度改变／碱基突变等研究表明,其环部为与靶分子rHuEPO-α相互作用的主要结合位点,而茎部的主要作用为稳定复合物的形成。并进一步针对靶蛋白的结合位点进行研究,去糖基化实验结果表明,当糖蛋白rHuEPO-α去除N连接的末端糖基后,仍可以与适配体807-39nt发生特异性的相互作用。因此,可初步推测,对于适配体807-39nt,蛋白rHuEPO-α与其作用的主要结合部位为其氨基酸序列。适配体807-39nt可以识别商品化注射液(益比奥和罗可曼)中不同类型的rHuEPO,亦从另一方面说明了rHuEPO的氨基酸序列为适配体807-39nt的主要作用区域。同时膀胱正常上皮组织的免疫组化实验证实适配体807-39nt特异性优于rHuEPO-α的单克隆抗体AE7A5,并发现适配体807-39nt与膀胱癌上皮组织间具有特异性相互作用。适配体807-39nt具有天然的茎环结构,在第四章中,基于此点我们建立了特异性识别rHuEPO-α的适配体型分子信标检测策略。分别构建"Signal-on"和"Signal-off"两种分子信标模式,依据适配体荧光信号的变化判断其结合靶分子rHuEPO-α前后分子构象的改变。对于"Signal-on"体系,淬灭DNA序列的长度、稳定DNA的杂交位置和金属离子Mg2+的浓度是其获得高灵敏度的关键因素,在优化后的条件下,未经任何富集手段可实现1 nM rHuEPO-α的直接快速灵敏检测,其LOD为0.4 nM。综上所述,本论文成功建立了凝集素导向的亲和SELEX技术,用于筛选rHuEPO-α的高亲和力、高特异性的ssDNA适配体。对筛选得到的适配体807和813进行了结构功能研究,并初步判定了其和rHuEPO-α的主要作用位点。其中亲和力和特异性最佳的适配体807-39nt(Kd=39±27 nM)有望成为新的传感元件,可为拓宽现有的rHuEPO-α检测方法,开发有效的针对rHuEPO-α诊断试剂提供了除抗体之外的新途径。