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原料乳在低温冷藏时嗜冷菌会大量繁殖,代谢产生耐热蛋白酶和脂肪酶,过多的耐热蛋白酶和脂肪酶将导致原料乳质量降低,产生凝块、发苦和脂肪氧化味,从而严重影响了乳制品品质和乳品工业的发展。国际标准中,原料乳的计数方法为IDF standard 101A:原料乳在6.5℃条件下培养10d,计数,此方法具有结果准确的优点;IDF Standard 132A:原料乳在21℃条件下培养25h,计数,此方法具有实验周期短的优点。一些新的技术被应用到嗜冷菌计数领域来代替现有的微生物平板计数法,但是这些技术不是成本太高就是实验条件要求太高,不适于乳品工厂的应用推广。当今PCR技术已经在食品工业的各个领域中得到了广泛应用,其快速、高效的特点非常适合现代化生产的要求,但是其不足之处是普通PCR技术只能进行定性分析,而能够进行定量分析的荧光定量PCR技术成本又太高。因此,本课题的研究重点是通过常规PCR技术和传统分析手段的结合,以克服前面所述的PCR技术存在的不足之处,建立一种新型的原料乳中嗜冷菌计数方法,从而实现简单、快速、适合乳品企业推广的目的。利用两种不同的国际标准方法对同一批原料乳中的嗜冷菌微生物进行培养计数,建立两者之间的相关性。比较了氢氧化锆法、柠檬酸-氢氧化钠法和三氯乙酸法三种原料乳中提取RNA的前处理方法,最终确定最佳前处理方法为三氯乙酸法。然后基于PCR技术建立原料乳中嗜冷菌的两种计数方法:16S rRNA-PCR计数法和Apr-PCR计数法。SYBR Green I是一种荧光核酸染料,与双链DNA（dsDNA）按比例结合后显著增强荧光强度值,能够显示出PCR反应前后体系的模板DNA的变化量,基于此原理实现原料乳计数的目的。对两种方法的试验条件进行优化,并与上述的国际标准方法比较。主要研究结果如下:（1）对原料乳运用IDF Standard 101A和IDF Standard 132A两种标准方法同时进行计数、得到IDF 101A（6.5℃培养10天）方法和IDF 132A（21℃培养25h）线性回归关系方程:logy=0.6303logx+2.121 5（y:IDF Standard 101 A结果;x:IDF Standard 132 A（25h）结果）和改进后方法（21℃培养48h）的菌落形成单位之间的线性回归关系方程:logy=1.4314logx-2.2988（y:IDF Standard 101 A结果;x:IDF Standard 132A（48h）结果）。（2）在原料乳中DNA提取中,比较了氢氧化锆法、柠檬酸-氢氧化钠法和三氯乙酸法三种原料乳的前处理方法,发现三氯乙酸法处理原料乳最为有效。然后采用四种不同的提取方法对三氯乙酸处理后所得到的产物进行基因组DNA的提取:沸水水浴法、溶菌缓冲液法、蛋白酶k法和试剂盒法,实验最后确定蛋白酶k法为提取DNA的最佳方法。（3）针对原料乳中嗜冷菌大多数为假单胞菌属的特点,建立了两种基于PCR和荧光定量技术的原料乳中嗜冷菌计数的方法:16S rRNA-PCR计数法和Apr-PCR计数法。实验优化16s rRNA基因的扩增条件,确定PCR体系的Mg2+为1 mM,最佳反应条件为:1min变性阶段（94℃）:1min退火阶段（64℃）;1min延伸阶段（72℃）,进行35个循环后10min延伸（72℃）。优化了apr基因的扩增条件,确定最佳反应条件为:1min变性阶段（94℃）;30s退火阶段（55℃）:30s延伸阶段（72℃）,进行40个循环后10min延伸（72℃）。确定了PCR反应体系荧光染料SYBR Green I的添加条件为:1μL SYBR Green I+990μL TE缓冲液+5μL PCR产物。利用两种PCR扩增计数方法对原料乳样品进行实际检测。采用建立的两种PCR扩增计数方法对哈尔滨市周边农场采集的27份原料乳样品进行计数检测。与国际标准培养方法IDF132A（21℃）的检测结果相比,本研究建立的16S rRNA-PCR计数法的检测结果的差异性不显著（P＞0.05）,方法的最低检出限为103 CFU/mL,检测时间在10h以内;Apr-PCR方法的最低检出限为104 CFU/mL,检测时间在10h以内,并且Apr-PCR方法计数结果与标准平板计数法的结果在统计学上存在显著性差异（P＜0.05）。本研究建立的16S rRNA-PCR计数方法适用于原料乳中嗜冷菌的快速计数检测。