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猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of swine, TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis coronavirus, TGEV)引起的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为临床特征的高度接触性传染病,不同年龄和品种的猪对其均易感,其中1-2周龄以下的仔猪致死率可达到100%,给养猪业造成极大的危害。预防该病的有效措施是疫苗接种,传统的常规疫苗的研制都是以大量培养病原微生物为基础,这不仅给疫苗的制造带来局限性,同时也存在潜在的不安全因素,如病原微生物灭活不彻底,导致强毒散播；弱毒疫苗存在毒力返强等问题。而利用转基因植物生产可食(饲)疫苗,具有成本低廉,安全性好,生产速度快,接种简单以及易于运输等优点,正在引起越来越多的科学家的关注。在TGEV结构蛋白中,S蛋白是唯一能在动物体内诱导产生中和抗体的主要结构蛋白。因此,S蛋白基因是研究TGEV基因工程疫苗的主要目的基因。本研究的目的是利用RT-PCR技术把S基因5’端包含A、D两个抗原位点的一段序列(S1)克隆入植物表达载体系统中,构建重组植物表达载体,通过农杆菌介导法转化番茄,使S1蛋白在番茄中获得表达,为研究TGEV可食性疫苗莫定基础。本研究根据GenBank数据库中的TGEV全基因序列(NC002306)设计了一对引物,针对S基因5’端A、D两个抗原位点的序列(S1),并合有XbaI和SmaI酶切位点。用RT-PCR技术从国内分离的TGEV HN-2002株中获得的PCR产物,经纯化后将其连接到pMD1 8-T载体上,连接产物转化E.coli DH5a,然后在氨苄抗性(Amp+)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。提取质粒经PCR, XbaI和SmaI双酶切鉴定,结果扩增片段与预期片段大小相符；DNA序列分析结果表明,扩增的S1基因大小为912bp,完全符合载体阅读框,与TGEV HN-2002株核苷酸序列和氨基酸序列符合率均为98%。将鉴定为阳性的pMD18-T／S1质粒与植物表达载体同时进行XbaI和SmaI酶切,分别经回收后连接。连接产物转化E.coli DH5a,然后在卡那霉素抗性(Kan+)平板上挑取阳性菌落,37℃过夜培养。提取质粒经PCR, XbaI和SmaI双酶切鉴定,扩增和酶切出的基因片段与S1基因片段大小相同(912bp),结果表明目的基因S1成功连接到植物表达载体35SCaMV+NOS上,与预计相符,将阳性重组质粒命名为35SCaMV+NOS/S1. TGEV S1基因植物表达载体构建成功。将阳性重组质粒35SCaMV+NOS/S1经电击转化进入农杆菌AGL1中,在卡那霉素和利福平抗性(Kan++Rif+)平板上挑取阳性菌落,28℃在5ml相同抗性的液体培养基中培养36-48h,取出100ul菌液于50ml相同抗性的液体培养基中培养12h至OD600=0.5-1.0。通过农杆菌介导法,将上述重悬菌液转染番茄子叶5min,转基因番茄受体经过共培养、脱菌培养、筛选培养、壮苗培养和生根培养不断分化长出绿苗,最终获得50株抗性植株。表明该转基因番茄体系可在实际中操作。对抗性植株进行PCR和RT-PCR检测,共在30株抗性植株中检测到目的基因片段(912bp),初步证实外源基因S1已经整合进番茄基因组中并转录为mRNA.对阳性转化植株进行Westernblot鉴定,结果显示在34KDa处出现与目的蛋白分子量大小相同的特异性条带,证实外源TGEVS1基因在番茄中成功翻译成蛋白质。本实验为TGEV转基因番茄疫苗的研究奠定了基础。