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目的：探讨重组质粒pACCMV-hTGF-β1基因经脂质体转染对人骨髓间充质干细胞分化的影响。 方法：1. 人骨髓间充质干细胞的分离与培养。成年人股骨大转子处抽取骨髓5ml，采用Percoll（1.073mg/ml）密度梯度离心方法分离出间充质干细胞进行原代培养，每隔2~3天更换含10%胎牛血清的DMEM培养基，观察细胞的形态变化及生长特点。传至第四代取部分细胞在成骨条件下诱导细胞（完全培养基中加入地塞米松10-8mol/L、维生素C 50mg/L、β-甘油磷酸钠100mmol/L）并进行碱性磷酸酶染色和钙化结节四环素染色。 2. 质粒pACCMV-hTGF-β1基因的构建及扩增： ①重组质粒pACCMV-hTGF-β1基因由上海第二军医大学微生物学实验室构建。②重组质粒的扩增：采用划痕法在平板培养基中接种大肠杆菌JM109菌液，37℃过夜培养，挑选单菌落于液体培养基中37℃剧烈摇震培养至OD260=0.3-0.4。③采用CaCL2法制备大肠杆菌感受态，然后加入含有目的基因的质粒cDNA，通过42℃热休克转化至大肠杆菌体内，继续于液体培养基中过夜培养。④将培养好的菌液平铺于含有抗生素和X-gal、IPTG的平板培养基中，通过抗药性筛选及蓝白斑试验挑选所需的大肠杆菌，继续于液体培养基中过夜培养。⑤采用离心柱式快速回收提取质粒DNA的方法，提取并纯化小量的质粒DNA，用分光光度法<WP=4>测定其浓度及纯度（所提质粒DNA溶液的浓度为0.067μg/μL、纯度为1.782）。⑥最后用限制性内切酶单酶切及琼脂凝胶电泳进行鉴定。 3. 骨髓间充质干细胞的转染。① 分为转染组和未转染组。转染前1天取生长至80%瓶底的第四代骨髓基质细胞以0.25%胰蛋白酶：0.2%EDTA（1：1体积比）消化后，以5.0×104/ml的密度将细胞接种于35mm的的培养皿中，每皿接种2ml细胞悬液。每个培养皿中预置4枚直径1cm的圆形盖玻片。② 按阳离子脂质体转染试剂TransFastTM Reagent说明书配制转染液。-20℃保存待用。③ 将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒转染骨髓间充质干细胞以检测优化瞬时转染效率。④ 将质粒pACCMV-hTGF-β1基因转染骨髓间充质干细胞。4. 转染后细胞TGF-β1的表达和细胞分化情况的观察。分别于转染后第2天、第4天、第6天和第14天行转染组和未转染组TGF-β1免疫细胞荧光标记，于第14天同时行Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白、Ⅰ型胶原和TGF-β1共同免疫细胞荧光标记，以了解细胞的分化情况。结果：1. 人骨髓间充质干细胞的形态学和成骨鉴定。 ①骨髓间充质干细胞原代接种培养后48小时，倒置显微镜下即可见稀疏分布的单个细胞，或小的细胞集落贴壁生长，细胞为梭形，呈典型的成纤维细胞样外观。细胞于2周时基本融合，此时，各细胞集落间呈放射状或漩涡状生长。分离的原代细胞经4%台盼蓝染色后活细胞率为100%；酶消化后的细胞呈皱缩的不规则形，活细胞率为93%-98%。 ②第四代骨髓间充质干细胞生长至50%-60%时，更换条件培养基进行培养，一周后，碱性磷酸酶染色细胞浆内出现棕黑色颗粒；大约2周时形成钙化结节，以四环素标记后，在荧光显微镜<WP=5>下呈金黄色。 2. 转染后骨髓间充质干细胞分化情况观察。 ①免疫细胞化学荧光染色显示，转染48小时后，部分细胞胞浆内即有绿色荧光细胞显示，转染后第4天和第6天细胞的荧光强度有所减弱，但数量无明显减少。第14天时，荧光细胞的数量和荧光强度均明显减少，偶有荧光强度较强者。以TGF-β1和Ⅰ型胶原蛋白抗体共同标记，发现经脂质体介导的TGF-β1基因体外转染人骨髓间充质干细胞后，于第14天仍有细胞呈强阳性TGF-β1基因表达。在TGF-β1基因表达阳性细胞周围细胞及其本身均呈Ⅰ型胶原蛋白染色阳性。 ②转染组细胞于第14天行Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白共同免疫细胞化学荧光标记，发现Ⅰ型胶原蛋白表达明显强于Ⅱ型胶原蛋白，Ⅱ型胶原蛋白呈部分弱染状态，而未转染对照组则无明显Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白表达。结论：1. 人骨髓间充质干细胞在特定的培养条件下可向成骨细胞分化，具有成骨潜能。 2. 经脂质体转染后的细胞分泌TGF-β1可持续较长的时间，至少可达2周。 3. TGF-β1可使人骨髓间充质干细胞向成骨细胞或/和成软骨细胞方向分化，其具体分化途径可能与细胞所处环境有密切联系。