研究背景:临床上,各种原因造成的骨缺损经常需要手术干预。目前,同种异体骨和自体骨的移植仍然是治疗骨缺损的主要手段。然而,感染、排斥和供体部位发病的风险以及有限的自体骨组织供应阻碍了其临床应用,并且仍然是必须解决的严重问题。因此,骨组织工程在治疗骨缺损问题方面具有很大的潜力。由于优异的机械性能和耐腐蚀性,钛及钛合金（例如Ti6Al4V）已被广泛用作骨科和牙科植入物材料。使用电子束熔化（electron-beam melting,EBM）打印的3D多孔钛合金支架与传统的钛合金支架相比具有更好的生物学性能,可以有效解决传统的固态钛合金支架的非物理弹性模量和生物相容性不足的问题。此外3D打印的多孔钛合金支架的有序微孔结构为生长因子的搭载及骨长入提供了合适的空间,对骨缺损的修复具有更强的作用。然而,由于EBM制造的多孔钛合金具有金属惯有的生物惰性。为确保植入物能与骨组织成功融合,有必要将生长因子（growth factors,GFs）应用于多孔钛支架表面以刺激成骨作用。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）最初是作为骨提取物中的骨诱导成分被发现的,目前已经发现其在各种组织及器官（包括骨、软骨、肌肉、肾脏和血管）的生长和发育过程中发挥重要作用。BMP是转化生长因子β家族的成员,并已被证明能调节干细胞增殖和诱导成骨分化。BMP9（也称为生长分化因子2;growth differentiation factors,GDF2）其基因首先在发育中的胎鼠肝脏c DNA文库中被鉴定出来,BMP9已被证明在胚胎基底前脑胆碱能神经元胆碱能表型的诱导和维持中发挥作用。此外,它还能抑制肝糖原的产生和脂质代谢关键酶的表达,并且能调节内皮功能和血管生成。此后被认为是最具成骨分化能力的BMPs之一,其比BMP2更具有骨再生潜力,同时也是血管生成和软骨生成的主要调节因子。将多孔支架与载体材料结合以进行生长因子的控释是解决植入物生物相容性可行的解决方案。这种方法可以改善植入物的生物活性,并允许持续释放生长因子。作为可控释生长因子的载体材料,可吸收温敏胶原具有可注射性、可塑性、低毒性和良好的生物相容性,能够为细胞提供适宜的生存环境,并且其在4℃保持液态,在37℃时成胶的特性使其在生物体内的应用变得更加便利,因此在组织工程应用中受到关注。但是,温敏胶原的机械性能较差,而3D打印的多孔钛合金具有良好的机械性能和内部多孔结构,这可为温敏胶原的填充提供理想的载体。在这项研究中,我们利用EBM制成的3D打印多孔钛植入物作为支架,并将掺有人重组（human recombinant,rh）BMP9的温敏胶原植入支架孔隙中,温敏胶原充当提供rh BMP9受控释放的载体。我们发现随着温敏胶原的缓慢降解,rh BMP9逐渐从多孔结构中释放出来,促进了多孔钛结构内部及周围的成骨作用。体外实验采用了骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）验证支架复合物的细胞毒性及成骨作用,体内实验建立了兔股骨缺损模型,分别在6周、12周评估骨长入,骨整合的作用。方法:1.使用EBM制备3D打印多孔钛合金支架,将温敏胶原与rh BMP9混合物注入3D打印多孔钛合金支架孔隙中。2.使用扫描电镜对3D打印多孔钛合金支架、温敏胶原、复合支架进行观察。3.采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）评估温敏胶原对rh BMP9的释放能力。4.体外实验中采用鬼笔环肽/DAPI染色、活/死染色和CCK-8毒性实验检测复合支架对BMSCs的细胞活性的影响。采用茜素红染色、实时定量PCR实验验证复合支架对骨髓间充质干细胞的成骨分化影响。5.体内实验中,建立兔股骨缺损模型,将实验组分为3组:3D打印多孔钛合金支架（e Ti）、多孔钛合金支架负载温敏胶原（c Ti）、多孔钛合金支架负载温敏胶原与rh BMP9的复合物（rh BMP9/c Ti）,将三组支架分别植入兔股骨远端外上踝处,在6、12周时取出支架,采用Micro-CT、组织学评估、免疫组化、力学推出测试的方法在骨缺损模型中研究复合支架的骨整合及支架孔隙中的骨长入情况。结果：1.制备出圆盘形（φ10 mm×L3 mm）和柱状支架（φ4 mm×L8 mm）两种钛合金支架,两种支架参数相同:孔隙率=70%,孔径=500μm。电镜下可观察到支架具有微米级的粗糙度,电镜下温敏胶原具有胶原纤维结构能为细胞提供良好的生存环境,且温敏胶原将支架包裹并充满支架孔隙。2.ELISA定量测定显示在第一天内rh BMP9在温敏胶原释放率达到了50%,在接下来的14天中释放速率持续降低。3.经过鬼笔环肽/DAPI染色、活/死染色和CCK-8毒性实验评估发现,与e Ti、c Ti组相比rh BMP9/c Ti组中BMSCs能够附着在支架上并具有良好的活性,并且BMSCs展现出纺锤形形态附着在基质表面。茜素红染色结果表明rh BMP9/c Ti组产生更多的钙化结节,且成骨标记物RUNX2,ALP,OPN,BMP-2均有所上调。4.建立兔股骨缺损模型,成功将e Ti、c Ti、rh BMP9/c Ti组分别植入到缺损处。Micro-CT显示rh BMP9/c Ti组的骨组织量要大于另外两组,且骨小梁分离度（Tb.Sp）是3组中最低的,骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁数量（Tb.N）均为最高。硬组织切片中的Masson、VG染色的结果与MicroCT结果趋势相同。免疫组化中证实rhBMP9/cTi组中的一型胶原表达量最高。力学推出测试证实rh BMP9/c Ti的骨整合强度要高于e Ti、c Ti组。结论:在本研究中,我们使用EBM制备出具有优良力学性能的3D打印多孔钛合金支架,并且将rh BMP9/温敏胶原注入支架中形成具有生物活性的钛合金多孔复合支架。经过体外和体内实验表明,此复合支架具有良好的生物相容性,能够缓慢持续地释放生长因子,体外促进BMSCs的增殖与成骨分化,体内能够增加骨缺损处的骨量,增强骨整合及骨长入能力。