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生长阻滞和DNA损伤基因(growth arrest and DNA damage,gadd)家族与细胞生长抑制和凋亡有关,该家族成员Gadd45a在维持基因组稳定性中发挥重要作用。Gadd45a可诱导细胞G2/M期阻滞,Gadd45a的缺失导致细胞G2/M期检测点异常。Gadd45a还可通过引发细胞骨架稳定性降低而诱导细胞凋亡。另外,Gadd45a在主动的DNA去甲基化中起重要作用,过表达Gadd45a促进基因组DNA的去甲基化,降低Gadd45a表达水平能导致DNA超甲基化而沉默基因。Gadd45a基因的表达调控发生在转录水平、转录后水平和翻译后水平,但有关该基因表达调控的表观遗传学机制尚不清楚。本试验利用RT-PCR、亚硫酸氢盐PCR测序(bisulfite-sequencing PCR,BSP)、染色质免疫共沉淀(chromatinimmuno-precipitation assay,ChIP)等实验技术对成年牛组织中Gadd45a基因表达情况及该基因3′端220bp调节区的DNA甲基化和组蛋白修饰等进行研究。并检测了该该基因调节区在体外受精胚胎、孤雌胚胎、核移植胚胎中的DNA甲基化状态。1、Gadd45a基因的表达利用RT-PCR检测成年牛心脏、肾脏、肝脏及睾丸中Gadd45a基因mRNA的表达。结果显示:心脏中Gadd45a基因不表达,其他三种组织中Gadd45a基因均有表达且表达水平略有差异。肾脏、睾丸组织中表达量较高,而肝脏中表达量偏低。2、Gadd45a基因DNA甲基化状态DNA甲基化是哺乳动物主要的表观遗传调节机制,DNA甲基化通过改变染色质构型影响基因表达。研究表明,DNA甲基化与基因的组织特异性表达相关。本试验选定Gadd45a基因3′调控区中的7个CpG位点,以亚硫酸氢盐处理的基因组为模板,进行PCR并测序,检测CpG位点的DNA甲基化状态,结果显示,心脏中的甲基化程度明显高于其他三种组织。说明调控区DNA甲基化与牛Gadd45a基因的组织特异性表达相关。3、Gadd45a基因组蛋白修饰情况组蛋白修饰是另一种重要的表观遗传调节机制,不同位点的组蛋白修饰可通过影响组蛋白与DNA双链的结合,改变染色质的疏松或凝集状态,或通过影响其它转录因子与结构基因启动子的亲和性来发挥基因调控作用。组蛋白H3乙酰化被认为与基因活化有关,而组蛋白H3K9甲基化与基因的转录抑制有关。本试验利用染色质免疫共沉淀技术对成年牛组织中Gadd45a基因3′调控区的H3乙酰化、H3K9甲基化状态进行了检测。H3乙酰化程度在心脏、肾脏中高于在肝脏和睾丸中的水平。H3K9甲基化程度在心脏、肾脏中也明显高于其它两种组织。表明Gadd45a基因调控区H3K9甲基化对Gadd45a的表达具有一定的抑制作用,而该调控区H3乙酰化对组织特异性表达影响较小。4、胚胎中Gadd45a基因DNA甲基化情况不正确的表观遗传重编程被认为是核移植过程中影响胚胎发育率及出生个体异常的重要因素。最近研究提示,少数关键基因的表观遗传调控重编程可能是影响核移植胚胎发育潜能的原因。本试验利用低熔点胶包埋技术对体外受精胚胎、孤雌胚胎、核移植胚胎中Gadd45a基因调控区DNA甲基化状态进行检测。结果显示:核移植胚胎甲基化程度高于体外受精胚胎和孤雌胚胎。表明核移植过程中Gadd45a基因存在着甲基化状态异常。综上所述,DNA甲基化和组蛋白修饰协同作用调节Gadd45a基因的表达,Gadd45a基因的组织特异性表达与该基因调控区DNA甲基化和H3K9甲基化相关。另外,在不同来源的胚胎中检测Gadd45a基因调控区DNA甲基化,结果表明,核移植过程同样存在单基因位点的重编程异常。