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抗缪勒管激素(Anti-müllerian hormone，AMH)属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族，现已证实TGF-β/Smad信号转导通路是调控卵泡发育的重要途径。在卵巢组织中，AMH由卵泡颗粒细胞合成和分泌，并且作为体内唯一抑制原始卵泡生长的细胞因子，能通过抑制卵泡募集和FSH敏感性影响卵泡发育。然而，还缺少关于鹅AMH基因功能及其转录调控的系统研究。因此，本研究克隆鹅AMH基因序列，分析鹅AMH基因编码区和启动子区域序列特点，构建AMH基因启动子系列缺失载体，通过瞬时转染和双荧光素酶报告基因活性分析鹅AMH基因核心启动子区，预测关键转录因子;探究不同阶段鹅卵泡颗粒细胞中AMH基因及其关键转录因子的表达特点和基因表达量间的相关性;共转染关键转录因子(GATA-4)真核表达载体及其结合位点定点突变的AMH基因启动子载体，通过双荧光素酶报告基因活性检测确认GATA-4能通过结合鹅AMH基因启动子进而调控其转录。主要研究结果如下:
(1)鹅AMH基因编码区序列2013bp，与鹅（预测序列）、绿头鸭、原鸡、人的相应序列同源性分别为96％、95％、85％、47％。AMH基因编码区内TGF beta结构域在物种间高度保守，而鹅AMHN结构域存在较多独特的突变位点，推测鹅AMH在调控性别分化及性腺组织发育方面可能与其他物种存在功能差异。
(2)鹅AMH基因启动子近翻译起始位点区域包括典型的TATA-box、SF-1、WT1以及3个GATA-4转录结合位点。
(3)步移缺失法成功构建了7个鹅AMH基因启动子荧光素酶报告基因载体，分别命名为pGL4.10-AMH1～pGL4.10-AMH7。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内的双荧光素酶报告基因活性检测结果显示，pGL4.10-AMH6的启动子活性显著高于PGL4.10-basic，其余载体的启动子活性均未显著高于PGL4.10-basic，暗示鹅AMH基因启动子-370bp～-126bp间存在核心启动子，-676bp～-370bp间存在重要的负调控元件;
(4)荧光定量结果表明，鹅AMH基因在卵泡颗粒细胞中的mRNA表达量随卵泡发育逐渐降低，在等级前卵泡内显著高于等级卵泡，在6～8mm和8～10mm、8～10mm和F5、F4和F3三组卵泡间下降最明显;推测鹅AMH在等级前卵泡中的功能与其他禽类类似，且在上述三个时间点内其功能可能发生了变化，表明鹅AMH基因在等级前卵泡发育过程中可能具有特殊意义。
(5)转录因子GATA-4与AMH的表达量呈显著的正相关(P=0.026)，WT1与AMH的表达量无显著相关性(P=0.458)，表明转录因子GATA-4参与鹅AMH基因的转录调控，而转录因子WT1不参与。
(6)成功构建转录因子GATA-4结合位点定点突变的AMH启动子荧光素酶报告基因载体3个，分别命名为pGL4.10-AMH2-GATA-4-M778、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1399和pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1477。在CHO细胞内的双荧光素酶报告基因检测结果显示，GATA-4的外源过表达使得pGL4.10-AMH2、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M778、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1399、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1477的启动子活性显著增强(P＜0.05)，分别增强了14.3、9.26、9.04和5.31倍。这表明转录因子GATA-4与三个结合位点均能结合，其中-1477位点的GATA-4结合活性最强，-778位点和-1399位点的结合活性相近。
综上，AMH调控鹅卵泡发育，GATA-4参与鹅AMH基因的转录调控。
(1)鹅AMH基因编码区序列2013bp，与鹅（预测序列）、绿头鸭、原鸡、人的相应序列同源性分别为96％、95％、85％、47％。AMH基因编码区内TGF beta结构域在物种间高度保守，而鹅AMHN结构域存在较多独特的突变位点，推测鹅AMH在调控性别分化及性腺组织发育方面可能与其他物种存在功能差异。
(2)鹅AMH基因启动子近翻译起始位点区域包括典型的TATA-box、SF-1、WT1以及3个GATA-4转录结合位点。
(3)步移缺失法成功构建了7个鹅AMH基因启动子荧光素酶报告基因载体，分别命名为pGL4.10-AMH1～pGL4.10-AMH7。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内的双荧光素酶报告基因活性检测结果显示，pGL4.10-AMH6的启动子活性显著高于PGL4.10-basic，其余载体的启动子活性均未显著高于PGL4.10-basic，暗示鹅AMH基因启动子-370bp～-126bp间存在核心启动子，-676bp～-370bp间存在重要的负调控元件;
(4)荧光定量结果表明，鹅AMH基因在卵泡颗粒细胞中的mRNA表达量随卵泡发育逐渐降低，在等级前卵泡内显著高于等级卵泡，在6～8mm和8～10mm、8～10mm和F5、F4和F3三组卵泡间下降最明显;推测鹅AMH在等级前卵泡中的功能与其他禽类类似，且在上述三个时间点内其功能可能发生了变化，表明鹅AMH基因在等级前卵泡发育过程中可能具有特殊意义。
(5)转录因子GATA-4与AMH的表达量呈显著的正相关(P=0.026)，WT1与AMH的表达量无显著相关性(P=0.458)，表明转录因子GATA-4参与鹅AMH基因的转录调控，而转录因子WT1不参与。
(6)成功构建转录因子GATA-4结合位点定点突变的AMH启动子荧光素酶报告基因载体3个，分别命名为pGL4.10-AMH2-GATA-4-M778、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1399和pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1477。在CHO细胞内的双荧光素酶报告基因检测结果显示，GATA-4的外源过表达使得pGL4.10-AMH2、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M778、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1399、pGL4.10-AMH2-GATA-4-M1477的启动子活性显著增强(P＜0.05)，分别增强了14.3、9.26、9.04和5.31倍。这表明转录因子GATA-4与三个结合位点均能结合，其中-1477位点的GATA-4结合活性最强，-778位点和-1399位点的结合活性相近。
综上，AMH调控鹅卵泡发育，GATA-4参与鹅AMH基因的转录调控。