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糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy,DR）是糖尿病最常见的微血管并发症之一,视网膜血管内皮细胞（retinal endothelial cells,RECs）长期暴露于高糖环境中,炎症反应和凋亡增强、细胞活性降低,破坏血-视网膜内屏障（inner blood-retinal barrier,iBRB）,使微血管渗漏性增强,出现微血管瘤、棉绒斑、硬性渗出等一系列的病理变化,导致患者视力下降,严重影响生活质量,加重家庭负担。RhoA/ROCK（Ras homolog gene family member A/Rho-associated coiled coil-containing protein kinase）和间隙连接蛋白 43（Connexin43,Cx43）均广泛分布于人体的各个组织和器官,参与多种关键的生物学进程,在维持内环境稳态中发挥了至关重要的作用,但在疾病中,它们的异常激活同样会引发一系列的病理改变,促进疾病的发生发展。本研究首次证明了在RECs中,RhoA/ROCK信号通路对Cx43的调控机制以及ROCK抑制剂对RECs的保护作用,表明高糖环境中RhoA/ROCK信号通路的激活通过破坏细胞间连接通讯（gap junction intercellular connection,GJIC）使iBRB的屏障作用减弱,促进DR的进展,同时为ROCK抑制剂改善DR微血管病变提供了理论依据。目的:探究在DR中,高糖通过激活RhoA/ROCK/Cx43信号通路破坏RECs及iBRB的分子机制,以及ROCK抑制剂对RECs的保护作用,以期为DR的早期治疗提供理论依据。方法:1.通过细胞实验验证高糖引起mRECs损伤的作用机制。分组:对照组（5.5mM葡萄糖）、高糖组（30,60,90 mM葡萄糖）、高糖+Y-23532组、高糖+fasudil组、RhoA过表达组。（1）对照组:mRECs在5.5 mM葡萄糖浓度培养24h或48h。（2）高糖组:mRECs在不同糖浓度（30,60,90mM葡萄糖）培养24h或48h。（3）高糖+Y-27632干预组:mRECs给予Y-27632 10 μ M处理30min后,改用高糖（30 mM葡萄糖）培养24h或48h。（4）高糖+fasduil干预组:mRECs给予fasudil 30 μM+高糖（30 mM葡萄糖）培养24h 或 48h。（5）RhoA过表达组:mRECs在5.5 mM葡萄糖浓度下培养,给予RhoA过表达质粒3 μ g培养24h或48h。qRT-PCR 及 Western blot 检测各组 RhoA、ROCK1、ROCK2、Cx43 mRNA 及蛋白质的表达水平,ELISA检测各组细胞上清中炎症因子TNF-α、IL-1 β、IL-6的表达水平,流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况,CCK-8实验检测各组细胞的活性,免疫细胞化学实验观察Cx43的位置分布。2.通过动物实验观察ROCK抑制剂fasudil对早期DR的干预作用。分组:对照组、糖尿病组、糖尿病+fasudil组。（1）对照组:动物无任何处理。（2）糖尿病动物模型:8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠连续5天腹腔注射链脲佐菌素（STZ）50 mg/Kg,一周后测空腹血糖高于16.7 mmol/L则造模成功。（3）fasudil干预模型:造模成功后的糖尿病鼠连续12周每天腹腔注射fasudil 50mg/Kg。qRT-PCR及Western blot检测各组RhoA、ROCK1、ROCK2、Cx43mRNA及蛋白质的表达水平,视网膜切片免疫荧光染色观察各组Cx43表达变化,HE染色比较各组视网膜厚度,视网膜铺片PAS染色观察各组视网膜血管内皮细胞及无细胞毛细血管数,Evans blue实验观察各组视网膜血管通透性的变化。3.统计学方法:采用GraphPad prism 8统计软件进行统计学分析,p＜0.05时具有统计学意义。结果:1.高糖激活RhoA/ROCK1信号通路促进糖尿病视网膜病变的发展。在细胞实验中,高糖处理视网膜血管内皮细胞,RhoA和ROCK1表达升高（p＜0.05）,而ROCK2表达水平不变,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β释放显著增高（p＜0.05）,细胞凋亡增多（p＜0.05）,细胞活性降低（p＜0.05）。表明高糖通过激活RhoA/ROCK1信号通路促进视网膜血管内皮细胞的炎症反应和凋亡,抑制细胞活性。在动物实验中,糖尿病小鼠的视网膜组织中RhoA、ROCK1表达水平升高（p＜0.05）,而ROCK2表达水平无变化,视网膜厚度变薄（p＜0.05）、内皮细胞数减少（p＜0.05）、无细胞毛血管数增多（p＜0.05）,视网膜渗漏增加（p＜0.05）。表明高糖通过激活RhoA/ROCK1信号通路加重糖尿病视网膜病变。2.RhoA/ROCK1通过调节Cx43的表达和位置加重糖尿病视网膜病变。在细胞实验中,高糖及RhoA过表达的视网膜血管内皮细胞中,Cx43表达水平显著降低（p＜0.05）,并且其位置从细胞膜内化到细胞质。而使用ROCK抑制剂Y-27632或fasudil后Cx43表达水平上调（p＜0.05）,其位置从细胞质转移至细胞膜。在动物实验中,与对照组小鼠相比,糖尿病小鼠视网膜组织中的Cx43表达水平显著升高（p＜0.05）,而使用fasudil腹腔注射的糖尿病小鼠视网膜组织中Cx43表达水平下调（p＜0.05）。3.ROCK抑制剂可以改善糖尿病视网膜血管病变。在细胞实验中,使用ROCK抑制剂Y-27632或fasudil处理视网膜血管内皮细胞后,炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1 β释放显著减少（p＜0.05）,细胞凋亡减少（p＜0.05）,细胞活性增强（p＜0.05）。提示ROCK抑制剂通过抑制RhoA/ROCK1/Cx43信号通路减缓高糖诱导的内皮细胞炎症反应和凋亡,提高细胞活性。在动物实验中,糖尿病小鼠连续腹腔注射fasudil 12周后,小鼠视网膜厚度（p＜0.05）及视网膜血管内皮细胞数增加（p＜0.05）,无细胞血管数减少（p＜0.05）,血管渗漏减轻（p＜0.05）。提示ROCK抑制剂可保护血-视网膜内屏障,从而减轻糖尿病视网膜病变。结论:高糖激活RhoA/ROCK1信号通路,破坏Cx43,使其表达水平下调并内化,加重视网膜血管内皮细胞炎症反应和凋亡,降低细胞活性,从而破坏血-视网膜内屏障,使血管渗透性增强,促进糖尿病视网膜病变的发生发展。使用ROCK抑制剂抑制ROCK1后可以改善RhoA/ROCK1/Cx43信号通路导致的视网膜血管内皮损伤。因此,本研究为糖尿病视网膜病变的发病机制提供了线索,对发现潜在有效的治疗早期糖尿病视网膜病变的药物提供了理论依据。