本论文以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei Zhang)为出发菌株,通过适应性进化获得了具有酸胁迫抗性的干酪乳杆菌进化菌株,利用微生物生理学和蛋白质组学的研究手段,研究了干酪乳杆菌原始菌株和进化菌株在酸胁迫条件下的生理应答及代谢调控,并在此基础上,借助生化工程与代谢工程的方法,提出了两种策略,有效地提升了干酪乳杆菌抵御酸胁迫的能力。主要研究结果如下:1)适应性进化改善干酪乳杆菌酸胁迫条件下的生长性能,通过70天的进化,获得的进化菌株生物量比原始菌株提高了60%,比生长速率增加了10%。而且随着进化时间的延长,进化菌株对酸胁迫的耐受性逐渐增强,进化70天的菌株对乳酸胁迫和盐酸胁迫的耐受性分别提高了638倍和3.5倍。此外,实验还研究了进化菌株对模拟人体胃肠道系统以及对胆盐的耐受性,结果表明,通过进化,菌株对模拟人体胃肠道系统的转运耐受和对胆盐的耐受性都有明显提高。2)从胞内微环境和细胞膜水平上比较了干酪乳杆菌原始菌株和酸耐受的突变株在酸胁迫前后的胁迫应激反应。酸胁迫引起胞内pH的显著降低,与原始菌株相比,进化菌株保持了更高的胞内pH(pHi)、H+-ATPase活性和胞内ATP水平。干酪乳杆菌利用H+-ATPase,通过消耗胞内ATP,排出胞内H+,从而保持胞内pH的动态平衡;胞内氨基酸分析结果表明,酸胁迫1 h后,进化菌株胞内积累更多的天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸和谷氨酸。细胞膜水平上的研究表明,酸胁迫引起细胞膜流动性的降低,但是,突变株却保持了较高地膜流动性;细胞膜脂肪酸含量的分析结果表明,酸胁迫引起细胞膜脂肪酸不饱和度、碳链长度和环丙烷脂肪酸含量的增加。胁迫45 min后,进化菌株膜脂的不饱和度和环丙烷脂肪酸含量分别是原始菌株的1.32倍和1.52倍。此外,酸胁迫还引起细胞膜完整性的变化,透射电镜分析发现,酸胁迫条件下,进化菌株能够更好地保持膜的完整性,减少胞内物质的流出及胞外有害物质的进入,从而有效地减轻了酸胁迫对细胞造成的损伤。3)通过2D-DIGE和i-TRAQ技术分析了干酪乳杆菌原始菌株和进化菌株在酸胁迫前后蛋白表达的差异。酸胁迫引起细胞代谢发生改变,与原始菌株相比,突变株具有更高地糖酵解效率、肽聚糖合成以及天冬氨酸和精氨酸代谢活性,有利于减少酸胁迫对细胞造成的损伤。此外,酸胁迫还导致与DNA合成、转录和翻译等途径相关的蛋白表达下调;而与DNA修复相关蛋白的Muts和RecO以及分子伴侣、冷/热应激蛋白如GroL、DnaJ和DnaK等表达显著上调。4)研究了天冬氨酸在保护干酪乳杆菌抵御酸胁迫过程中的作用。外源添加天冬氨酸显著改善干酪乳杆菌酸胁迫条件下的生长性能和存活率,在pH 4.3的培养条件下培养64 h,添加天冬氨酸培养的菌株L. casei (Asp+)生物量比对照菌株L. casei (Asp-)提高了1.70倍,菌株经pH 3.3胁迫处理3 h后,细胞存活率比对照菌株提高43倍。同时,分析细胞生理特性发现,与对照菌株L. casei (Asp-)相比,L. casei (Asp+)保持了更高的pHi、胞内ATP及NH4+浓度。此外,代谢组学分析表明,天冬氨酸增加了干酪乳杆菌糖酵解途径的代谢通量,L. casei (Asp+)保持了更高的6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、3-磷酸甘油酸和乳酸含量;进一步研究发现,L. casei (Asp+)保持了更高的天冬氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸浓度以及更高的油酸及环丙烷脂肪酸浓度。定量PCR分析结果表明,酸胁迫引起天冬氨酸往精氨酸代谢途径中的关键基因argG和argH表达上调,而往天冬酰胺和丙氨酸代谢途径的基因asnH和asdA表达下调;同时,酸胁迫条件下,天冬氨酸的添加,菌株L. casei (Asp+)中argG和argH基因表达显著高于对照菌株。5)在L. lactis NZ9000中表达来源于L. casei Zhang的RecO蛋白,研究其对菌株酸胁迫及其它环境胁迫抗性的影响。表达RecO蛋白后,工程菌NZ-RecO对酸胁迫(pH 5.0)、盐胁迫(3% NaCl)和氧胁迫(0.1 mM H2O2)的生长性能明显改善,30oC发酵28 h,菌株NZ-RecO生物量比对照菌株NZ-Vector分别提高了22.03%、37.04%和19.37%。此外,工程菌对高酸胁迫(pH 4.0)和高渗胁迫(15% NaCl)的存活率分别比对照菌提高2.90和3.28倍。盐胁迫(3% NaCl)条件下发酵28 h,菌体对葡萄糖的得率、乳酸对葡萄糖的得率和乳酸生产强度分别提高了50%、43.48%和41.67%。