前言WNK4 (with-no-lysine kinase-4)是新近克隆的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的编码基因,该基因第7外显子和第17外显子错义突变可导致常染色体显性遗传疾病-Ⅱ型假性低醛固酮血症(Pseudohypoaldosteronism typeⅡ, PHAⅡ),主要表现为高血压和高血钾。研究表明WNK4主要作用于肾脏远曲小管和集合管上的多个离子转运体和离子通道,比如Na-Cl共转运体(Na-Cl co-transporter, NCCT)、髓外钾离子通道(Renal Outer Medullary Potassium channel, ROMK)、上皮钠通道(Epithelial Sodium Channel, ENaC),从而起到对体液离子平衡和血压的调控作用。目前大量的研究集中在WNK4的功能上,而WNK4基因调控机制仍不清楚。基因组包含编码序列和非编码序列,其中编码序列在人类基因组中所占比例不到5%,非编码序列超过95%。过去很长一段时间内认为这些非编码序列是“垃圾DNA (junk DNA)",现在人们逐渐认识到这些非编码序列对基因的表达发挥着重要的调控作用,尤其是基因的5’和3’侧翼的非编码区。本研究组前期对hWNK4基因的5’启动子区进行了研究,发现hWNK4的启动子并不含有TATA盒,它包含多个潜在的转录因子结合位点,比如Sp1、GR、GATA-1、AP1、AP2、NF-κB和C/EBPα等。李春义等证实在启动子区的-285和-337位存在两个糖皮质激素反应元件(glucocorticoid response element, GRE),地塞米松(dexamethasone, Dex)可通过这两个GRE抑制hWNK4的转录活性。李苗等发现在启动子区的-426位存在一个GATA-1反应元件,应用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)可以增加GATA-1的乙酰化,增强其与反应元件的亲和力,从而影响启动子的活性,上调hWNK4的表达。这些关于hWNK4基因的5’启动子的表达调控研究对阐明高血压的发病机制有重要意义；然而,hWNK4基因的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)的调控作用迄今未见报道。微小RNA (microRNA, miRNA)是近年来生物学研究的一个热点,是一类长度约19-25nt内源性单链非编码RNA分子。研究表明miRNA通过调控基因表达参与了生命中的一系列重要过程,包括早期发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡以及细胞死亡等。大部分实验证明动物miRNA通过与靶基因mRNA的3’-UTR不完全配对结合,在转录后水平负调控基因表达。因此,本研究拟重点探讨hWNK4基因3’-UTR的作用和功能。通过生物信息学、报告基因载体构建、real-time PCR、Western Blot等实验技术验证hWNK4 3’-UTR的作用以及其上的潜在miRNA结合位点,从而探讨hWNK4 3’-UTR参与基因表达调控的机制。材料与方法在萤光素酶报告基因载体pGL3-Basic基础上,利用基因重组技术构建多种质粒,包括pSV40-luc、pSV40-luc-UTR、p484-luc、p484-luc-UTR、p337-luc、p337-luc-UTR、p216-luc、p216-luc-UTR。利用Lipofectamine 2000分别转染人胚肾细胞系HEK293、人胃腺癌细胞系BGC823和人宫颈腺癌细胞系Hela,应用DUAL-GLOTM双荧光素酶检测系统检测荧光素酶的活性。应用染色体构象捕获技术观察hWNK4 3’-UTR与启动子的远隔交互作用。利用生物信息学软件对hWNK4基因3’-UTR进行miRNA靶向预测。在pcDNA3.1(+)基础上构建miR-296的表达载体pmiR-296,并购买了miR-296的抑制剂(Ambion)。利用瞬时转染技术过表达miR-296或抑制miR-296表达,通过萤光素酶报告基因、Real-time PCR及Western印迹杂交等实验进行验证。结果1、通过UCSC Genome Bioinformatic (http://genome.ucsc.edu/)对多个哺乳动物的比较,WNK4序列具有高度保守性,其3’-UTR区一致性达95%。2、在HEK293、BGC823和Hela中分别转入pSV40-luc或pSV40-luc-UTR,发现hWNK4 3’-UTR具有增强子作用,将异源SV40启动子换为同源的484-bp启动子后增强子作用仍存在,但是在各细胞中的作用强度不一致。3、应用染色体构象捕获技术观察到hWNK4启动子和3’-UTR之间存在远隔交互作用,彼此可能在空间上相互靠近形成DNA-袢结构。4、将一系列含有5’截短的hWNK4启动子和／或3’-UTR的报告载体分别转染HEK293、BGC823和Hela,发现3’-UTR对不同长度启动子的影响不同：对全长484-bp启动子有增强作用；但是对337-bp启动子基本没有作用；对216-bp启动子呈明显的抑制作用,提示3’增强子和5’启动子区顺式反应元件对hWNK4转录有协同调节作用,启动子-484至-337区可能是3’-UTR发挥增强子作用的关键区域。5、对转染细胞施与hWNK4启动子的刺激剂(TSA)或抑制剂(DEX),不改变对hWNK4 3’-UTR增强子的作用趋势,同时TSA还可提高3’-UTR对484启动子增强作用的敏感性。6、应用miRanda、TargetScan等软件,在hWNK4第3775-3795nt位置预测到一个miR-296的结合位点,其与小鼠、大鼠、狗和马的同源性高达95%。7、在HEK293细胞中抑制miR-296表达可使带有hWNK4 3’-UTR野生型序列的报告载体荧光素酶活性上升；过表达miR-296,使荧光素酶活性下降,而且不论是SV40启动子还是WNK4启动子都有同样的作用。对带有hWNK4 3’-UTR突变型的报告载体给予同样的处理因素,荧光素酶活性基本没有变化。证实了miR-296靶向作用于hWNK4 3’-UTR,而且miR-296对基因的调节作用并不依赖于启动子。8、将pSV40-luc-UTR和pmiR-296共转染到HEK293,BGC823和Hela细胞中,发现在HEK293和Hela细胞中过表达miR-296使荧光素酶活性下降；而在BGC823细胞中没有抑制作用,提示miR-296对基因表达的抑制作用具有细胞特异性。9、将pmiR-296转染到HEK293细胞中,应用Real-time PCR检测内源性hWNK4 mRNA水平没有减低。将pHA-WNK4与pmiR-296共转染到HEK293细胞中,应用Western Blot检测hWNK4蛋白水平有下降,并呈剂量依赖性,提示miR-296在转录后水平抑制hWNK4的表达。结论1、hWNK4 3’-UTR具有增强子作用,并且与启动子之间存在远隔交互作用,某些转录因子及其结合位点可能是3’-UTR和启动子彼此连接的桥梁。2、miR-296与hWNK4 3’-UTR存在靶向作用关系,且miR-296对基因表达的抑制作用存在细胞特异性。miR-296在转录后水平抑制WNK4的表达。